miRNA模拟物的转染体系与步骤

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希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。
7 g% G* m  C- z- W; {" ~0 U我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

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8 y' i+ y" x. p
1 b# L9 w5 h# p. V1 {- H- V( A# I0 P
大家看能不能参照这个
: ^$ k; j, f. i" u* IsiRNA 的转染（24 孔板为例） # B: h: N6 y9 m2 j% ]" g# e0 D
I．准备细胞： 5 R- L8 o; z) ]# [" A
贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)  " N; M. K3 h7 s5 G# b; o7 K
悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。 1 d  ]8 D% B4 t% E  I

9 V' c0 ^2 D5 iII．对于每个转染样品，按下面的方法准备：
8 {- U3 n9 x/ V  n  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。 . L& u7 j& `  I3 b, t1 q. ^
  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。 $ o. g. `6 s* g' E
  混合转染试剂和siRNA稀释液， 轻轻吹吸3 - 5次混匀， 室温下静置20 min。  : m# s- h5 U! }; M/ }
  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。  
5 I( n. K; `3 |6 E( E9 N  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。

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自己顶。

rain2402

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。
  U5 W- y- }5 U% l3 OA. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
6 `& p1 C1 H0 KB. siRNA-RFect混合物准备：. i: X# Z1 h! T( U3 X3 m
1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。& B8 h$ C( k4 [, _6 @
2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。4 ~; G" F6 x$ x
3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。3 f$ A: Q8 ]* p( i1 [
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：
& o# w" j( ?- S* ~1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。3 O& E2 l, s5 V# X. X' b/ g# Q# _
2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、
3 m" q5 e) c9 @9 n; Z, [所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

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十年了