miRNA模拟物的转染体系与步骤

runsong

希望讲得尽量详细，包括所用试剂、体系成分、操作步骤及转染效率。
9 h+ H$ e. A3 i+ d" b3 [我用的是上海吉玛公司的，不带荧光。

runsong

十年了

做个好孩子

这是用RFECT转染方法，本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。2 R4 X8 q! k. D& }! P
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。
  k/ g3 {" c! f: d; ^. @! LB. siRNA-RFect混合物准备：. r. B# o1 A8 p1 E
1. 6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。
* ~9 w- u( ]  `' a3 E. B2 c0 o# i2. 2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。/ A0 C  n  q8 S# b
3. 孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。
; T& \- X( i& S; y9 Y& k2 a! {C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：
/ k$ Y, N3 O& W1. 将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。7 z) s" b$ B" F6 J5 m2 Z3 a) K( e
2. 37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、$ y$ I& s0 d* s$ ?( w2 A. \
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。

rain2402

你的步骤是基本可以的，但是转染的试剂和siRNA的浓度比例，却要自己摸索，因为每种细胞可能都不会一样，你可以按照转染试剂的使用说明来操作。

runsong

自己顶。

runsong

3 r- f- `- g* w8 ]; R, l/ h1 g$ _" e* o
大家看能不能参照这个8 K. B- W) j2 S+ j# V* P
siRNA 的转染（24 孔板为例） ( J+ _9 B2 A' Q$ ^
I．准备细胞：
2 t9 y1 G2 P# n贴壁细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆生长。)  ! c) x3 @3 ^# {9 Q' \# O
悬浮细胞：转染前 24 hrs，在 500 uL 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105个细胞，转时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。
) _! A) z* P6 b5 z+ c% Z: a
6 l9 F! M' ~6 s0 Y9 _II．对于每个转染样品，按下面的方法准备： + s5 o5 Q2 Z% ~1 T' N; e
  用 50uL Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM)  ，轻轻吹吸3 - 5 次混匀。
; y4 g$ W! }0 ^* z/ b+ p  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50uL Opti-MEM 稀释 1.0 uL Lipofectamine TM 2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。 " e- K* M1 L! f* N
  混合转染试剂和siRNA稀释液， 轻轻吹吸3 - 5次混匀， 室温下静置20 min。  5 _, F$ a/ I$ v  ~. B1 l& x6 R
  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 uL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。  
& ^+ Q# F, b0 q- q  o5 V  L  细胞板置于37度、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可换新鲜培养基。