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我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA,我们设计了三条引物:一条反向引物用于反转录,一条正向引物,还有一条通用的反向引物,同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸,其5’端的36个核苷酸序列是固定的,形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构,其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸,在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补,而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt,其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分,而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。& w6 U, k8 q( \- H( g3 {7 ?
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