请教mi-RNA茎环法设计引物

runsong

预用stem-loop法做RT设计micRNA引物，网上和文献里找到了两个版本的，不太一致。( u, V! n) X% x# b; A
版本一：查到以mir-145为例的帖子
  S/ v* _. f7 C& F! y              反转录茎环引物固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数八个碱基的反向互补序列。& C( T) M  ?* N! s7 ^
              PCR正向引物固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG，在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列。5 [& w1 I: {7 J. [# `( v4 q7 Z
        PCR反向引物为：TGGTGTCGTGGAGTCG, P; n, I5 o) ?7 V5 F7 l
版本二：应用似乎更加广泛2 \1 [$ o& o) K% x/ a$ ]. ]- c( u2 o" m0 J
              反转录茎环引物固定的序列为：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数六个碱基的反向互补序列。
* h* O& G" `1 v; p% n5 s% f
5 I1 f- @/ }5 M5 {' G/ b$ P              PCR正向引物固定的序列叙述含糊，多为成熟体去除后面2-8个碱基而剩下的序列。4 @- i/ l9 s% r, H, j
              PCR反向引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT
& s/ s+ P7 ]4 w, y3 N' S0 Y0 D困惑ing...
. Z- {2 O0 F& V" x1 E6 v  Y+ y0 h/ L4 A( z/ F( P/ H
这两个系统原理一样，不知有何优劣。5 v2 J& w6 A5 |( \: M+ W9 m2 K

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runsong

预用stem-loop法做RT设计micRNA引物，网上和文献里找到了两个版本的，不太一致。
: z7 V8 F- w) z$ t版本一：查到以mir-145为例的帖子
7 }) v% T4 K4 @& `" {! o              反转录茎环引物固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数八个碱基的反向互补序列。  H$ u2 a2 Z6 b4 Y
              PCR正向引物固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG，在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列。0 S0 R. K9 g9 d1 C/ \) p
        PCR反向引物为：TGGTGTCGTGGAGTCG5 D7 q# T/ r1 t4 i6 h- q( e; w  M  O
版本二：应用似乎更加广泛8 M. ?7 M7 R7 m  d5 n/ i
              反转录茎环引物固定的序列为：5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3，再在后面加上目的miRNA成熟体从后面数六个碱基的反向互补序列。
0 U. L7 F: X5 u* M7 E/ i9 w              PCR正向引物固定的序列叙述含糊，多为成熟体去除后面2-8个碱基而剩下的序列。
  b( |& t+ x* i6 L- v              PCR反向引物为：GTGCAGGGTCCGAGGT7 X( Q' [# c; O+ H' c% K
困惑ing..., ]( Z$ p0 |2 _3 k% T1 G
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这两个系统原理一样，不知有何优劣。, ?1 N4 a* L1 f2 j3 d2 N

1 K6 k  a' x, d# f

runsong

自己顶

runsong

悬赏没人要？！
6 y5 Y, O; i% R

runsong

回复 mckf111 的帖子/ [( n1 d8 h- ?# G" t% `, ?( t

; X" ^, L. P0 w  S, G可以用5s，要是你还没解决的话我把序列发给你

runsong

回复 mckf111 的帖子
8 [( T# U  s. }4 S7 Z1 ?
5 ]) l& P9 x+ L( t  p第二种方法上游引物的通用序列是啥？

runsong

回复 gunther 的帖子
* Z, K' e3 g: N
' n2 _; e; q4 U; H" \我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。
2 I( @5 u" `, d2 f5 `其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。

runsong

回复 gunther 的帖子& U$ B4 h6 t( U# A* a' r$ }9 o

# |8 C5 Y% t; H) P0 j* [不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。
& h  ~) x! |9 s! V1 i/ fforward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。
; w% U8 d% V' i# J这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。! d; T0 ~4 l: o* f5 Z- S0 I7 B8 \
# n1 u6 e; L; _9 B' U9 X! @$ _
呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。