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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑
% u/ O) u9 }* Z# Q& V
d; P- `+ U. Z( _% A铺皿后19小时左右，观察细胞密度：! P1 t- f$ D8 o( x; S. B
) S8 n7 l3 V; h* P3 s& T2 y# x# B( V) _+ l) q1 x( v# P2 U2 c
实验准备：
& u7 z6 m( ~. h: {( @7 V1、培养基：DMEM+10%FBS
8 a2 i3 I. N' D8 v) x: J2、lipofectamine 2000 （invitrogen）3 l7 H# I3 e3 U' Q8 b) G d3 y
3、OPTI-MEM （GIBCO）
6 n8 H$ |8 ] v! w3 U. ?1 }% R* B9 f4、质粒
0 v8 J5 d! \ N9 O. l 两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP# a" I" s$ F8 \7 {+ L
MSCV-IRES-GFP* X$ y* h9 S8 M" t5 U' v1 T
两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG
) c* G+ `# l7 l% d6 i+ R$ ~+ {6 t0 q3 Z; k+ \
实验步骤：
6 w/ z1 A* N" O# n' o1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。
# l* B; j$ ^6 A& P0 z2、制备质粒-lipo 2000混合液：
6 I4 p3 K) ~7 r/ s$ v（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）- J( G2 d, c+ ~3 j! h' q
/ }: w+ {$ }3 ]/ }, ?. }5 n$ C" q' s# A （a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）
+ T* J1 {( @( b$ ]4 F2 Y （b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）% H; S M. p8 P `% b7 v! B/ W* \4 |
（c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）
' U6 j' o8 Q2 a3 ]! ~ （d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min
4 i- c- z& p$ }2 w4 Z0 c3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。
\7 N7 ?* ]) |" ?- H4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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发表于 2009-8-20 12:01
发表于 2019-6-18 20:58
