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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑
0 U, i9 ~% T7 i3 Z; y, U0 @+ B! U$ |8 z
铺皿后19小时左右，观察细胞密度：
7 ~: t$ f' S6 K, g( |
7 ]- r4 ~& k# m9 d2 |: s1 M$ L" [' Q0 s% G# B0 @
实验准备：
, q/ m" \( |7 y1 b V/ Z1、培养基：DMEM+10%FBS+ s8 ?/ r# x! Y, }$ q+ ?& c
2、lipofectamine 2000 （invitrogen）* U% A g) U! c% c2 z
3、OPTI-MEM （GIBCO）
|/ D5 |9 C9 N) S6 [4 k4、质粒2 n* _' b. `5 p! ^( L3 J
两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP
, ^% l! U5 z ^" e/ [/ ~ MSCV-IRES-GFP
6 [8 C& [. r# [" ^ 两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG
9 T# a( ^ ]4 B: }( S* G8 D1 b" t" e! W _3 c* p
实验步骤： L+ A h7 P" i2 h' @
1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。+ E- y H! x$ C5 S' H) n8 M
2、制备质粒-lipo 2000混合液：
6 v% P& n( B( T9 Y8 F（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）4 V; U( f- C/ i ?. V
* e4 S, o& I% L' z" E
（a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）" g N! Y; F. P/ D$ G6 g; d) v% x
（b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）
3 a6 @% c( F0 n- x （c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）7 g8 n5 E g ~! d. F
（d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min
7 ~2 C$ d- M" g. h H) G' [3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。
5 s' m; \6 E O4 j/ s. Y$ w, b4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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