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1．制胶及上样：4 n" T+ r+ g9 l' S
（1）配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。
9 j$ _% C4 Z: q' i5 `' z2 V- y2 c（2）待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。待胶完全聚合。 {7 F. v6 f; R
（3）将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。
, J+ @7 a, l3 x+ O8 t# P（4）小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。
2 H& x/ l+ ]2 N x9 j6 M/ `（5）分别取50μg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按4：1体积比加入5′样品缓冲液，以1′样品缓冲液？配平上样体积（总体积20μ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。1 t2 S: { S% R1 T
（6）将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。
_$ m# a/ g* j2．电泳, |1 f, ~7 T8 y0 R
（1）接通凝胶电泳仪的电源，初始电压70V。（约30分钟）5 ?$ y }, V; W* R
（2）溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。（约60分钟）+ e( n% X, D# H" I+ _
3．转膜( Y3 `2 A. x4 l# d$ p* e
（1）从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。) ]4 \" W' t. E5 x/ Q
（2）取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。
r5 f9 P# C* t# [* S（3）按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。
0 Q/ U% J! q S+ w* V) j% I（4）将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。
2 c9 l3 F5 N6 i' v" t4．染色. L& g8 F. w _" h: |5 e- y# h- k
（1）将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。
) r, K3 ]: B4 r i+ B4 i（2）蛋白质条带出现后，用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。! ]' M" Z, H5 P b# i+ r# m
（3）按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。3 Q/ |6 t0 P3 {. [
5．封闭
' N9 a6 k! V. ^. X5 B, s2 w6 B q- g9 P7 H+ E+ `6 B# h: p8 `4 V# p
" O0 l9 R, P/ a( p; j( U# g" M把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。1 m' g, x& g, ?/ z
6．洗膜与杂交
- _+ C! {/ G3 }/ G2 c（1）以T-TBS洗膜，10分钟′ 3次。
# h$ b, N; i1 g（2）第一抗体封闭： SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。
$ z1 N- c1 D4 p4 i a2 a（3）以T-TBS洗膜，10分钟′ 3次。
[& l. ]9 x' {2 x（4）第二抗体封闭：辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体（1：4000），按0.1 ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，室温下振摇60分钟。
5 C: }$ G. n: j% h! V% g, p' D（5）以T-TBS洗膜，10分钟′ 3次。
# N1 V2 w+ b1 M& G7．化学发光与曝光6 F) A6 _5 t0 K9 b$ X; B0 |! k
（1）将化学发光试剂盒中的两种试剂各取0.5ml，按1：1的比例混合，在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1分钟。
- z) A6 W6 A& ^% ?（2）用滤纸沾干膜上的液体，用保鲜膜包好，用感光胶片在压片盒中曝光约1分钟。' n/ a8 ?. ]* k$ K* N V
（3）曝光后的感光胶片在显影液中显影约30秒钟，定影液中定影1分钟，用水冲洗后晾干。
* M8 T6 |7 l; E% i1 n2 C（4）根据曝光情况调整曝光时间，重复压片、显影及定影，选择满意的胶片。
. s% s G/ i# g1 P（5）重复实验三次。 |
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发表于 2009-6-4 15:20
