求助，关于Ki67免疫荧光染色的问题

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  对pc3细胞做Ki67免疫荧光染色，但是怎么染，Ki67都是胞浆着色。我查了下，Ki67是核蛋白，应该就是核显色才对啊。我上网查了下，好多人也是出现这样的问题，然而并没找到解决方法。我的整个流程是这样：
, b+ @; k( G2 G% W$ t细胞多聚甲醛固定0.5h，0.5%triton打孔0.5h，pbs洗，BSA封闭1h，Ki67在4度孵育过夜，pbs洗，二抗室温避光孵育1h，pbs洗，DAPI室温孵育0.5h，pbs洗，甘油封片，荧光显微镜观察。我对于免疫荧光已经做过很多次了，自认为没有什么手法问题。希望有大神可以帮解决下。
6 r8 I/ f# E5 w) D* w下面是我做的片子：1 g0 H, @* ^: Q. ]

2016-3-9 22:19 上传

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ki67

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dapi

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忘说了，红色荧光是ki67，蓝色是dapi

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回复 顺其自然 的帖子7 {" c+ ^  [+ n7 c

2 N& o8 K2 K) J% l感谢，总算有人回复了，我一抗按1:200稀释的，不过是按说明书来稀释的，但是我想的是如果一抗再稀释些的话，那会不会只染了胞浆呢，不过我还是试试吧也，谢谢啦~

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回复 biovictor 的帖子! s3 @; ~6 |& D$ j' ?9 h

# `( }! d5 X5 p, H我是直接细胞长好后用多聚甲醛固定的，理论上不用抗原修复

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回复 biovictor 的帖子
' f: q3 ]/ @9 r: J+ [& E9 Y4 r& Q, K8 e& ]. u6 V
0.5%低吗？我看大家用的都是0.1,0.2%的呀。至于这个核膜没打开的事我问了我老师，他说既然细胞膜被打孔了，理论上核膜就也被打孔了，而且貌似核膜本身就是有孔的吧？我现在怀疑是一抗不好使，打算换个一抗

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# x) [5 O! w! O5 _7 y3 T, D对这个完全无解...