免疫荧光染色步骤 越详细越好

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免疫荧光染色步骤的文章或视频     越详细越好 谢谢

moluxingke

看文章看视频，真不如在自己详细了解相关原理之后，动手做上一遍。然后再把遇到的有关问题请教其他人。

jenny114402

免疫荧光分为胞内核蛋白和表面蛋白1 v( I0 Q) M: u) {
核内蛋白染色步骤：4 y, m- R% @- w# G! ~( l8 g2 V: [
1.在24孔板内接种细胞，1ml培养基培养，待细胞长到30%-50%染色3 o$ N$ O$ e3 ]% |
2.吸弃培养基，PBS洗两次4 z3 `* y. h; ]8 d0 z6 ]; m; Q
3.4%的多聚甲醛固定25min
2 S+ m$ r# J" q0 z- y4.PBS洗3遍! P( z3 U" k8 i9 _) ]3 q1 j1 b
5.250ul 0.25%TritonX-100，室温20min- j: f1 [2 \7 L; T& V2 m
6.PBS洗3遍1 Y& `- ]  m% ]( H# Y
7.200ul 10%的山羊血清，室温封闭30min
3 p: h0 m" e( u  n9 H8.弃封闭液，加一抗，避光4度过夜
( G( B/ z# C$ O) P) j; b9.PBS洗3遍. Z# C( G# e; A% P. z6 a' H
10.加二抗，避光室温2h! }2 H: _6 t5 Q
11.加稀释好的PI/DAPI，避光室温20min$ |$ C( P( x7 R$ l% B
12.PBS洗3遍，镜检。

jenny114402

表面蛋白省去TritonX-100打孔

1195963542

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  @. c+ J: N% }
, r: _6 o/ B1 W: N6 Y8 N) W' M8 ]+ \OK  
* \5 X% R+ g/ b& T6 {$ O0 v

倒腾细胞

回复 jenny114402 的帖子" h0 p4 @/ V2 Y" j6 R- x

7 ]4 \/ X1 I' H  D# w4 g. }请教前辈 细胞量有没有讲究  现在在六孔板培养大鼠MSC 过几天想做免疫荧光看细胞fibronectin和iNOS的表达  第一次做没有任何经验！细胞爬片又是有什么用处。

jenny114402

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5 [- {; o+ A) C% `) g/ t$ ]
4 ]/ e% R. A/ Q我做的是人的MSC，细胞量是5*103， 第二天做的免疫荧光

jenny114402

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; R$ B# q8 G+ U2 P+ R! d; U2 Z# |0 B* f! H9 k8 Y- V
细胞爬片就是那个玻片是包被过的，有强吸附能力；说白了就是细胞不易洗掉。

jenny114402

回复 倒腾细胞 的帖子' p/ F8 y- J7 V$ e$ i5 c9 @" D

- J# }1 m% \) R$ ?( s+ E我说的是5*103是24孔板的细胞量，我们一直都用24孔板做免疫荧光，检测mark有点多

倒腾细胞

回复 jenny114402 的帖子3 j: t  S& Z& I: {. v  i- J. _
! @6 U9 B' X) P5 S9 ^6 r% p
我得先用六孔板做transwell间接共培养24h  之后打算接着就用六孔板做IF  不过貌似细胞数量就很多了。。。。。难道要24h再消下来重新计数接种到24孔板吗？