关于构建microRNA过表达质粒的问题

iamxuchen

最近想构建microRNA的过表达质粒，转入ES细胞看效果，各位请问用什么质粒载体较好？带GFP的还是pCDNA3.1好？我可能做好几个，直接把前体序列PCR出来插入就可以了吧？

iamxuchen

还有一个问题就是克隆出的pri-mir片段需要加上ATG的序列吗

chenzhongyan

哪位大侠赐教一下。我也打算做。现在一无所知

weiyepan

回复 iamxuchen 的帖子7 C  ?/ X" \4 r. G

0 O1 ^# Q4 d# J不用ATG的，你需要哪种miRNA，如果是人的话好多公司都有全套的，例如复能基因，你可以打个电话去问一下，那里好像自己也有载体，带GFP的也有。

xiphias

请看2004年一篇science 的文章。
# Q% j$ C& `5 P$ J+ B% m0 e# SMicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation
3 B- N- B) ]% ~5 }' R+ {, ~. n
+ k: {( q4 g  f" ~只克隆前体序列是不会表达miR的。( u3 Q* T+ M0 ^% i
不需要ATG。7 J! s. D! M+ ^( _& D
个人觉得有GFP，或者抗性会好点。

xiphias

回复 xiphias 的帖子
- T2 a  c  o4 q- C7 q
2 W. w, @  y: r# v# F, M microRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation..pdf (1.27 MB)

2012-4-13 17:41 上传

请用IE浏览器下载
miR表达
下载积分: 威望 -2 , 包包 -5

& N: x, v1 z$ i& \
. z: \8 [6 L% |% m- N8 _$ ^1 R
All constructs with at least 40 nt on each side of the 67-nt hairpin were efficiently processed into
+ z. Y6 r; n! ethe mature miRNA (Fig. 3B)

jkfly

我自己做用的pCDNA3.1，并且成功了。另一个没做过。

iamxuchen

jkfly 发表于 2012-4-13 18:19   n) E$ ]8 A( c& l. s" E5 z+ N
我自己做用的pCDNA3.1，并且成功了。另一个没做过。

. X1 R: n, |  a/ k7 a+ @% g
追问下，我自己做的pcDNA3.1过表达感觉效率不是很高（293里面），也就8倍多点，听别人说用T7启动子的会好很多？

茅草无敌

我也想问问就是构建pEGFP载体到底需不需要将atg放进去啊？

86964109

miRNA构建是不是U6或H1效率高啊