u6启动子的问题

hndxws

最近做shRNA，用的是pBSU6质粒，接入shRNA时，采用的酶切位点是ApaI-gggcc/c。但在具体操作时，有的是用ApaI切过后，要把该位点变为顿末端，就是把ggcc去掉了，然后再连上shRNA，还有的是合成时直接合成了个粘末端的shRNA，直接连上去，这样两者的差别就是ApaI上的5个碱基ggccc。# K2 S+ J) H1 Y+ I7 m. a. y- V
有人说，U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G，这样好像第二种做法有点问题，不知到底是怎么样的？做过的同仁请给点意见，或提供点具体的操作资料。Thanks！

ambassador

' t1 h" w. A# d) |

8 v* }" s$ O4 @你的这个问题具体怎么解决我不太清楚，不过你上面的“有人说，U6启动时有固定的转录起始位点”，这个不要亲信他人说法，看看这个文献，对你一定有帮助：
, N4 ?% S2 W7 Z$ ^- ^6 `3 B* `
) w! w3 R$ O$ t# d/ ]0 E' CSURVEY AND SUMMARY Transcription by RNA polymerases I and III 2 s1 s, j, q3 a, I
http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/28/6/1283
! M, U! F$ M! m, q) z' V' |: S& u' X, B; Y. h& O0 b. Z2 }$ ?
  M- t& |+ G& U/ j  h6 t9 M3 }& `
希望解决问题后能分享给坛子上的宝宝。

hndxws

因为大体上大家都知道怎么回事，就是具体的实验操作设计细节很难找到。我参考一下，看看能不能找到具体的东西，找到了的话就再发到这里。请用pBSU6做过这个的同仁也来讨论一下,给点提示。

hndxws

做shRNA的paper很多，但是用pBS/U6的不是很多，就我目前查到的具体操作还是这两种。具体操作是：
5 L! ~; @0 k+ q9 [! R3 x第一种，依次用ApaI、T4 polymerase（或Klenow酶），EcoRI（或其他酶）切割pBS/U6，ApaI是必须要选用的，最后一个酶可以随意选。合成的shRNA的5‘端应该设计成平端的，3’端是黏端的。3 K- D, U9 K' y" P3 w
第二种，直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切，这样合成shRNA时，两端都应该设计成黏端的。
4 g( E- x- Q" h! I% a0 g$ E这两个操作的paper我都有看到，而且第一种方法的paper稍多点。但是两个方案哪个更好，没有具体的证据。我这次做这个时，开始没有注意到这个细节，设计的时候，按照的是第二个方案做的，因为第二个方案简单。如果在不知道U6promoter是否是精确起始转录时，先想到的肯定是第二种方案。& e' }8 _+ ]0 ^: h2 k# O& F' ^
等过一段时间，我做个转染，收个样看看是否第二种方案效率会受影响，就说明第一种方案是不是多此一举或者是必须要按第一种方案做。一切结论都是需要证据的。

hndxws

最近做了两次实验。用病毒介导shRNA转染细胞试了一下干扰效率，发现干扰效率还是很可以的，所以我觉得第二种方案对实验是没什么影响的，也就是说，可以直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切接入shRNA。5 M( y# ]+ }  z8 q4 ]
所以就我看来，有的地方说“U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G”。这个说法应该质疑一下。+ m$ @+ P7 }$ G
至于第一种做法和第二种方案哪个好，我没对比过，至少第二个方案是没问题的。

runsong

你好，我想用pll3.7做shRNA，也是卡在如何确定U6启动子转录起点的问题上，不知到底需不需要在意这个问题，请赐教。

hughliang

回复 runsong 的帖子9 [, @: |, o1 Y7 s- y8 e
$ S8 U6 i! h7 j  E
我用这个慢病毒的改型病毒做过shRNA的表达! c4 a3 s% q, F
; Q: X5 r; w+ ?% H& U. m
同这篇帖子一样，也是双酶切后连入，证实有干扰效应。
6 `) f; _2 e4 u  B+ m9 T
! c" ]; M. W# \) [/ ^官方Protocol也证实这一点：% D/ B! y1 v1 A6 V; i5 o

$ n; j$ _" `6 p8 Ehttp://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/pll37cloning.htm
/ P6 z6 o1 k% |' g4 p

hughliang

1 W- S3 G$ T. y. Z; n, j1 n' ~4 b% D  h5 R1 r1 j! j
在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：  u  I' G, L  x! [) Q
0 O! _2 Q0 @/ {
表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。
: f5 T" L2 Z4 [. e& G, C7 `3 L8 Q+ ?) p& {1 n% Q( K. y6 ?
可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。
( P: c, @0 o0 s) E: \' K/ ~' B
7 R2 ]; Q+ z5 e! x: E1 K向大家请教原因和克服的办法，先谢！: k: G" W- S+ {- c9 A* s

fguw

回复 hughliang 的帖子+ T# W4 T- W5 k- ]

3 a  O# b$ ^, [( k3 t可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，3 _0 @$ Z% i( q; H. p
没有实验结果验证，猜的, a% z- i: L9 Y0 N& `1 I' `( H
作普通转基因有类似问题，
! t* J' b$ g% `8 u' g! O有问题，欢迎探讨

runsong

/ d# V9 s- D# _% g% T

4 M2 f7 l0 F- c8 }; \/ r! D回复 hughliang 的帖子
$ `$ y7 ?" P6 G; W" _2 k9 m/ R( b: l# d1 g7 L$ ~
十分感谢，你提供的线索太有价值了。
2 J( C* A0 |7 g& P0 p% d" Q6 g/ P即pll3.7中3 s; r, {( |- W3 F8 b
An HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6.% X6 }4 |: \0 o& ]. {7 T4 v  ~6 i: M
引物设计应为 Sense oligo: 5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC
; s0 V( R. A+ _, A' w7 f$ J* Z2 g而且这个方法与一篇中文文章的做法一样。$ \) }) K: U; L3 ^- x
《Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定》（钱倩）