u6启动子的问题

hughliang

fguw 发表于 2011-8-16 02:24
6 P4 b6 r2 Z/ h2 i- k回复 hughliang 的帖子7 m! L; C# {- n4 t1 R6 t4 o! G! Q4 m
# @2 X' {" ?/ q; D  J
可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

: Z8 [0 C" y& h1 a) S+ V是有这个可能。  S8 t/ c& C4 {0 S+ N/ i9 p; @

% `3 R5 r( v$ ?4 K1 G) C但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

hughliang

runsong 发表于 2011-8-16 12:23
+ h! P- U1 J3 q; d回复 hughliang 的帖子
* a5 L4 Z( O8 S- [6 ~* h7 T- N; O6 \& e" O1 S0 G- |, V$ Q
十分感谢，你提供的线索太有价值了。

! _& Z  X- G) ?6 `
不客气
$ {# i( B$ n# F  A, o/ F0 \- S
# W$ ^2 C' c' ^' Q# O也分享两篇供参考
7 G* n& s, D2 G  {4 K/ X( I/ O
7 R- n) c1 z% q; w$ p# J1 z祝实验顺利
% ~" x- G6 Z( w' ~9 D/ p8 b# a# F! b9 l) I

fguw

回复 hughliang 的帖子
6 c; d. ^& o% g; c4 }1 \4 ^: {2 z* c0 S0 I4 I" f8 H. M4 B
我觉得你做试验的细胞是多克隆？没有挑单克隆？
0 u* F# E- I' n9 Y, d: f6 Y流式证实转染细胞仍有荧光，大概阳性细胞比例多少？
4 r9 l1 o% U3 z3 Y9 H" p1 a& O1 n如果比例比较低，可能WB检测时更多的是非阳性细胞细胞（失活）信号。所以KD效果不好。
' Y9 f+ u) t- H% p# f还有，SHRNA 和GFP使用不同的PROMTOERS，可能在不同的LOCUS活性不一样，当然，我不太认同该观点。

hughliang

回复 fguw 的帖子# Y: Q$ A0 l5 O" M1 v/ J

6 ]! T* {, c9 o- `是的，偷懒没挑单克隆。  U3 g% y8 @$ P" J8 l+ z8 k% K1 X
2 }* }+ k: C! e  w" Q
我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。
; _+ y% b9 A( j# G+ D
0 X2 z  N1 k& G6 D) ^流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。# n2 `( h7 L$ |6 @4 {  U3 c- t
% J0 d$ x/ y) }/ G8 r
谢谢！

sarah19860420

回复 runsong 的帖子5 U0 @+ v; m( t) e* z- `
7 K* z* I+ r+ ^: Y* a1 b/ S4 ]4 K
您好，我现在也是想用PLL3.7做shRNA。然后之前看帖子有的人说要形成这样的一个结构forward oligo：酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT
: _) C* ?) b% E- j7 Y: preverse oligo：酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C! }2 f6 r* P; C4 x+ p6 q* q
- C  @7 n, j7 N6 {; ]0 U
我想问的就是这个G点就是你们所说的U6转录起点的问题吧。那如果siRNA这个核心结构的开头就是以G开头的，还需要加G吗，你们的转录起点问题怎么解决的。我的载体是PLL3.7，酶切位点是Xho I，NOT I。能不能给我点建议。实验室没人弄过。所以想得到一个确定的答案。

w20043459

膜拜各位大神