求助双酶切的问题

军医

我用双酶切speⅠEcoRⅠ 双酶切，但是这两个酶切位点紧挨着，切了一会儿没切开，有没有人提提建议啊，该怎么办呢？谢谢了

274996064

这两个酶切位点要是离得很近的话是不能用这两个酶切的    他们中间最少要有6-10个碱基   我建议你重新找酶切位点

lifescience1

你所指的切了一会是多长时间 10分钟 还是1小时  ？8 C, z) ~* i8 j  A3 Y
我们一般酶切的时间按是1到3个小时之间哈  只要EcoRI 和SpeI两个的酶切位点没有重复哪怕只相隔一个碱基都能切开哈。

ljzmy82

酶用的是哪个公司的呢，NEB的还是Femertens,还是用好公司的酶，双酶切不成问题的5 z8 a1 X9 X3 K7 w6 f* t! W

jun8013

分步酶切，必要去磷酸化

军医

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9 {7 U0 R! L: F. f' j' f
& t2 V# R# o/ Y5 ~; K& w, p  i6 I前面都做了好多了，重新找就得返工了，我先用EcoRⅠ切了10小时再往体系里加speⅠ,又切了5个小时，在用CIAP处理，这样可以吗

军医

回复 ljzmy82 的帖子9 ], U/ V3 W6 @: U" ?$ ?" R

. i+ e5 {3 w& F! p# r都是NEB的酶

军医

回复 jun8013 的帖子& v5 h% |, p$ z5 P. }" K

, W4 N/ d4 F2 W我先用EcoRⅠ切了10小时再往体系里加speⅠ,又切了5个小时，在用CIAP处理，NEB的酶里这两个酶有公用buffer的，用EcoRⅠbuffer.

lifescience1

回复 军医 的帖子! c5 w4 a) j1 S# L6 ]; W

0 c- e  i6 d# c# E如果两个酶的buffer相同的，即可共用的话 你可以将两个酶同时加入，不用一个一个的加入，
2 s! J" R3 m# S; c& V* R6 [还有就是酶切的温度  通常是37℃或30℃。

lifescience1

回复 军医 的帖子( x2 @6 l! F" h6 \7 N+ s& [
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如果两个酶的buffer相同的，即可共用的话 你可以将两个酶同时加入，不用一个一个的加入，
6 [9 T7 |% F) g2 a9 @( H0 w还有就是酶切的温度  通常是37℃或30℃。