求助双酶切的问题

军医

我用双酶切speⅠEcoRⅠ 双酶切，但是这两个酶切位点紧挨着，切了一会儿没切开，有没有人提提建议啊，该怎么办呢？谢谢了

274996064

这两个酶切位点要是离得很近的话是不能用这两个酶切的    他们中间最少要有6-10个碱基   我建议你重新找酶切位点

lifescience1

你所指的切了一会是多长时间 10分钟 还是1小时  ？
; @; K5 E* p0 }) |% N& |( _( K我们一般酶切的时间按是1到3个小时之间哈  只要EcoRI 和SpeI两个的酶切位点没有重复哪怕只相隔一个碱基都能切开哈。

ljzmy82

酶用的是哪个公司的呢，NEB的还是Femertens,还是用好公司的酶，双酶切不成问题的; T" Z- W& H+ o+ Q

jun8013

分步酶切，必要去磷酸化

军医

回复 274996064 的帖子, i, `1 L: I, ~5 l2 ?  y" k* H* R

! J, A; K" Q; Z" q' H9 p5 J+ H7 n5 j前面都做了好多了，重新找就得返工了，我先用EcoRⅠ切了10小时再往体系里加speⅠ,又切了5个小时，在用CIAP处理，这样可以吗

军医

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" m4 K' e/ [$ p. N7 ~  C- u) `5 E7 @' V9 R" Z3 y% ~
都是NEB的酶

军医

回复 jun8013 的帖子$ B9 O& W6 e% R6 Q  i+ Y

6 B  R' M! j9 n0 E  w我先用EcoRⅠ切了10小时再往体系里加speⅠ,又切了5个小时，在用CIAP处理，NEB的酶里这两个酶有公用buffer的，用EcoRⅠbuffer.

lifescience1

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. N7 e0 }8 r/ V如果两个酶的buffer相同的，即可共用的话 你可以将两个酶同时加入，不用一个一个的加入，+ ~) x5 U+ F' w$ d! i& v& R
还有就是酶切的温度  通常是37℃或30℃。

lifescience1

回复 军医 的帖子9 ?- ?/ q: m  i
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如果两个酶的buffer相同的，即可共用的话 你可以将两个酶同时加入，不用一个一个的加入，
  i- b7 T5 c  P0 \- t还有就是酶切的温度  通常是37℃或30℃。