western操作步骤，分享一下，感谢对我的帮助

keigo

1．制胶及上样：2 ^' Z" D* n+ B2 u+ D8 s* q
（1）配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。4 i; G4 N* {' M/ ^: n6 K
（2）待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。待胶完全聚合。4 f/ t) q( _7 `( v7 W0 U! Y. d
（3）将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。' P0 H) ^: n' j, Z1 ^* ^
（4）小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。. Q4 T- g" ]5 f" g2 m. O! {
（5）分别取50μg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按4：1体积比加入5′样品缓冲液，以1′样品缓冲液？配平上样体积（总体积20μ1）后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。
9 u% Z4 S" D$ {8 c' c# Q; @（6）将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。5 k$ Y! F& }& q, d$ X
2．电泳
' P2 Y  J1 a  M4 C+ z, v9 Y（1）接通凝胶电泳仪的电源，初始电压70V。（约30分钟）2 j  d% F  Y1 e9 C
（2）溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。（约60分钟）
, @1 \6 m8 r3 M7 P% C+ l3．转膜
4 M% L9 I! f/ {（1）从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。
2 w+ F$ h8 G8 G$ \! z（2）取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。
2 a/ T' C, W/ H; z0 r4 P; i; q  k（3）按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。
. b3 Z, |" i. a5 e* J1 y（4）将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。
0 _  S8 V7 V7 M" I4．染色
# V( O8 Z( ?' x（1）将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。' z" ]; E7 P7 S8 X/ C$ f
（2）蛋白质条带出现后，用去离子水洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。/ k( z' L( N: N7 C; r
（3）按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。( Y: k% q# }# T6 l; V
5．封闭2 m) O6 Q+ x! L2 b! F# w& u
9 v1 z) L& {8 y
6 `/ J, C) J3 M, {  K- X' ?" o
把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。2 n+ A" c0 w5 @- G& U
6．洗膜与杂交* d8 }$ {: p0 [2 `& y
（1）以T-TBS洗膜，10分钟′ 3次。
2 |1 d* W  N' Y（2）第一抗体封闭： SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。
$ F/ o- n" b  C3 G% Q（3）以T-TBS洗膜，10分钟′ 3次。. {( O; A) h5 W4 J6 Y: G+ y
（4）第二抗体封闭：辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体（1：4000），按0.1 ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，室温下振摇60分钟。
. `" W' o/ r! F4 @& [（5）以T-TBS洗膜，10分钟′ 3次。; Y* {$ l& L; P, c) _
7．化学发光与曝光
7 X& K7 j; e  T/ a（1）将化学发光试剂盒中的两种试剂各取0.5ml，按1：1的比例混合，在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1分钟。- A2 n; B( i7 z5 R
（2）用滤纸沾干膜上的液体，用保鲜膜包好，用感光胶片在压片盒中曝光约1分钟。
6 R! g" b1 f1 Y7 K* o（3）曝光后的感光胶片在显影液中显影约30秒钟，定影液中定影1分钟，用水冲洗后晾干。& Q% x6 s( O  {. Z1 f8 u3 g
（4）根据曝光情况调整曝光时间，重复压片、显影及定影，选择满意的胶片。
5 C. W* \6 s! I9 r. `$ j9 y（5）重复实验三次。

have-a-rest

应该注明蛋白提取方法，目的蛋白分子量。
$ ?1 M0 f/ ]) E' F这个可以算是实验记录。! g& D. h- J& p6 J
如果要写实验protocol，好多参数不是定量，要根据情况选择调整。1 U$ ?  M2 N& ]* N
谢谢楼主分享！