关于构建microRNA过表达质粒的问题

iamxuchen

最近想构建microRNA的过表达质粒，转入ES细胞看效果，各位请问用什么质粒载体较好？带GFP的还是pCDNA3.1好？我可能做好几个，直接把前体序列PCR出来插入就可以了吧？

iamxuchen

还有一个问题就是克隆出的pri-mir片段需要加上ATG的序列吗

chenzhongyan

哪位大侠赐教一下。我也打算做。现在一无所知

weiyepan

回复 iamxuchen 的帖子: j$ _- C) N7 m# n& y6 G; O

7 T: n$ j8 l4 e2 r不用ATG的，你需要哪种miRNA，如果是人的话好多公司都有全套的，例如复能基因，你可以打个电话去问一下，那里好像自己也有载体，带GFP的也有。

xiphias

请看2004年一篇science 的文章。# w4 J. e+ o% {2 P
MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation
3 W- k$ [: |  w# v, i6 ^$ M) S. V* u6 |# O9 _0 @6 X
只克隆前体序列是不会表达miR的。9 m3 p# Z+ S8 \7 i
不需要ATG。
; K( a! {$ P  q9 w; g个人觉得有GFP，或者抗性会好点。

xiphias

回复 xiphias 的帖子
4 D8 ~  e! X; j; ?
; n4 u* s3 y2 s5 V* d! K microRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation..pdf (1.27 MB)

2012-4-13 17:41 上传

请用IE浏览器下载
miR表达
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8 y6 D0 L9 m& J6 Q: k* d
5 U6 S; o2 j8 r& R* f) B9 d. h  ?/ PAll constructs with at least 40 nt on each side of the 67-nt hairpin were efficiently processed into' V4 g, q; d! k  y" I
the mature miRNA (Fig. 3B)

jkfly

我自己做用的pCDNA3.1，并且成功了。另一个没做过。

iamxuchen

jkfly 发表于 2012-4-13 18:19
& ~. T+ e. g- z1 Z4 c$ m我自己做用的pCDNA3.1，并且成功了。另一个没做过。

1 A  A, c" L4 _8 k) M
追问下，我自己做的pcDNA3.1过表达感觉效率不是很高（293里面），也就8倍多点，听别人说用T7启动子的会好很多？

茅草无敌

我也想问问就是构建pEGFP载体到底需不需要将atg放进去啊？

86964109

miRNA构建是不是U6或H1效率高啊