关于慢病毒转染的几个问题咨询

wangwang1987

1. 刚刚在addgene买了几个plasimd. 但是又四个是以Tet-o 开头，有四个是以Ptight 开头.想知道有什么区别么.! D4 N. w- o9 S% c  ]( `2 [8 V
2. 各位有用psPAX2和VSVg 包装的protocol么？因为刚刚开始没什么头绪的感觉，不知道具体用量.. O8 V6 @1 i" Y) z# q) ^

telomerase

我们用的是pMD2G的那个，过程差不多9 \' g" C, `" m) J9 C3 d* C
和包装逆转录的过程一样，我们用的是lipo，方法请参照lipo用法  L4 N' W2 y5 S
9 P  a5 `/ t) S: e6 j# I
要注意的是：
3 E8 B% q' q: `质粒的比例比较重要1 k# N/ ]0 G4 g- Z2 w: O
细胞的状态比较重要
* V2 M$ }' A; _- X3 H包完浓缩下，超离或浓缩柱5 L4 O5 n  ~% x& E" o# K
感染时必需要加polybrene，离心效果更佳

wangwang1987

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. P1 ]8 K5 ]5 p9 g! A/ O1 w$ r4 s6 V9 f9 X6 |
谢谢~还有一个问题就是2X HBS的PH的问题。因为不知道多少合适，我想验证那一个PH下可以滴度 更高。结果博后说太麻烦，让我直接做。现在只做了一个2X HBS加入细胞后第二天的液体的PH变化。我觉得这样很不准确的感觉~~但是也不知道怎么去反驳~~

telomerase

2X HBS- b6 N2 J+ d% M- `2 ~

" k- v4 c2 _" _" o6 y8 e: Y& b280 mM NaCl-----8.18g / 500 mL
. v+ c  |4 m" H$ g/ `" y( G, `. |, p, H; c5 E
10 mM KCl-----.18g/ 500 mL8 ]6 e- s1 p+ d' S" S+ J
. ?* |0 y9 @) ~& c
1.5 mM Na2HPO4 * 2H2O-----.2g of Na2HPO4 / 500 mL
4 @( g2 T2 A: N8 r& d: K6 P
$ C( _( Q% T3 i& g' Q' P* K* W12 mM Dextrose-----1.08g / 500 mL  2 K, r& z" x  R) }7 K% o
( S' v8 g4 T* w# u, \
50 mM HEPES----5.96g/ 500 mL
- P6 Z& }; f+ l' {8 w
7 |( ?; @2 w* l" nCarefully pH to 7.05 and raise to 500 mL volume. Aliquot and freeze. : `9 j# j9 O5 r# f) i
是这个吗？没用过。。。。。。。。
9 Q0 L1 f) j8 s+ c1 h# h但看配方PH是一定啊！！！
& T/ a8 q' v5 f7 U: C- P- S

daviddow

直接用lipo算了

daviddow

直接用lipo算了

huangcong1988

回复 telomerase 的帖子. D5 A/ Y4 I! i: K4 m

/ E' x8 d$ R2 G" a7 m我直接是收集的慢病毒里面加PEG8000（终浓度为10%），然后混匀后静置过夜，然后6000~8000离心半个小时，然后就得到沉淀，这样行吗？我看他们有的加蔗糖，不知道我加PEG8000有影响么？

huangcong1988

回复 wangwang1987 的帖子4 m' A8 p, S7 I, x  M
7 M9 b4 a+ F2 r, {) ~( y' E
现在包毒基本就是 FuGENE HD和lip2000，个人用的是lip2000，觉得效果还行，转染过程跟普通质粒转染差不多，要注意的也就是telomerase说的那些

wangwang1987

回复 huangcong1988 的帖子: U) @- z, N8 \' U

3 a5 D1 ?4 P# g- y+ A9 x/ p* V谢谢~~

xxh83121

大家的慢病毒载体都是从哪里买的？是已经包装好基因的还是空载？新手，望大家支持