qPCR大家关心的是神马？

xiao6tao

我最新作qPCR很郁闷，ct值忽高忽低，而且总是10倍稀释的时候ct值得差别大于3.3甚至小于3.3.6 _: B, m% q$ B
我有几个疑惑。
& o* g* u) M/ L7 E5 P! B相对定量与CT值有关，那么扩增的荧光值最低到多少才算合适。我的荧光平台才到0.42 U& z9 x4 E9 ^( D' h
都说rna在-20度不能保存过久，我的已经已经在-20°一个多月了，还能用吗？
  T, e, d3 N8 r2 a- s  Q关于溶解曲线，那个峰我的也是很低的，峰才到1.6
+ S* m  r# D; A- n! g2 U- J求各位高手帮忙

goodboy

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+ @+ r. e0 d5 i% Q' V' E" N. i7 S5 ~( G* }8 v+ n1 \2 F$ R
RNA在-20度确实容易降解，建议你放在-80度或直接重新提取，要不然你跑个琼脂糖电泳看看能否跑出三条带，不行的话只能重新提取。置于Qpcr，我之前将模板梯度稀释ct值变化也不是很一致，这可能与加样有关，建议你配好mix后分装不要一个一个的添加

xiao6tao

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3 @! \% s  O0 Z: E( M
$ x7 O* l# H: ]% u恩，谢谢！但是我想知道你们的荧光值一般到几啊 我的是不是太低了，才到0.5左右。溶解曲线峰值才到0.26

sirius_zou

1.qPRC我关心的是重复性和灵敏度，复管之间CT值差异关系到SD 值，也关系到实验的精确度。灵敏度的话主要是通过标准曲线体现出来。, A/ X& ]; e4 c1 l3 N7 b4 x
2.理论上待测样本10倍稀释后CT值相差3.3，但实际不是绝对的，只有尽量接近3.3，高于3.3说明样本或反应体系里有PCR抑制剂，比如RNA提取时酚氯仿是否去除干净，低于3.3说明扩增效率高于100%，可能是整个体系原因，也可能是引物非特异性扩增。1 |2 c' m. G! W1 n
3.关于样本：RNA在-20度下是很难保存的，LZ可以跑琼脂糖电泳看看条带，如果是两步法qPCR最好将RNA及时反转录。
& J- O$ `1 J, a  I) i2 t% ?3 A1 o4.关于荧光值低的问题，我以前也遇到过这个问题，用不同公司的试剂荧光值差异很大，还有就是方法的影响，LZ用的是probe还是SYBR？LZ的荧光值才0.5确实太低了，基本可以忽略不计，应该不是mix的原因，可能还是RNA降解了。重提RNA试试。