请教mi-RNA茎环法设计引物

mckf111

回复 runsong 的帖子. t0 Z9 _4 c0 L7 b/ T9 \5 B
, S' o: C2 W1 u' C
5S也可以做内参么 人和鼠可以共用同一引物扩吗. g# h% G9 z7 M+ ^2 X! l
引物序列是什么 还烦请指教

mckf111

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( M$ i) b) B- N! q  Z# V% O: D4 @
应该是5'-GCCCGC再加上15bp左右miR的5'端序列 注意把U改成T

王乾

我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA，我们设计了三条引物：一条反向引物用于反转录，一条正向引物，还有一条通用的反向引物，同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。. U4 {1 M( I6 h) \1 E

gunther

"而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度"
- C: F& n( e6 o& I0 t4 U) x9 E) T$ J# D* ~是这样吗？. v! k' q( ~# o  Y* Q
所以forward前面的4~6个nt序列总是不一样。$ m. d; m0 o8 F& B9 q6 m
; [, |7 D! I- L' h
sunsong最后找到答案了吗？我也想知道！

gunther

7 X4 C6 w% V* W" D, _: T我看文献好像前面那段并不是通用序列，不同mir的forward都不一样，真的仅仅是为了改变TM值吗？- _. f; ]4 ~6 F( Z' G
3 I1 e0 S: z9 C( \8 w3 d2 L: v& O6 D
另外，为什么前面一定要多一段序列呢？! y( ]. W0 f6 m  T& f

runsong

回复 gunther 的帖子4 e" D3 J( O- B* i( U1 k
9 A* J; f" q7 T
我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。
: c, ^' p2 |$ E! Z. r7 q7 X) `其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。

runsong

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0 H  H6 |" I' w* j/ d. O5 o3 h, C  y6 {  |1 l; X" M" J* x
不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。
- i% C" H" Q2 b; Iforward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。: [# X0 U2 Z" `! ?! M
这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。
* ?: g$ ?8 |2 s, X2 F. ]5 }% ]- f( s- b8 [- U/ W! m3 U
呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。

wolf1978

我的建议：进行miRNA引物的设计具有一定的难度，与常规的引物设计差别较大，不是每个都能成功。最好能够选用公司现成的一些产品，包括TaqMan探针、burgle stem-loop引物等等，节省时间，把握性更大！

foodmic

如何设计特异的茎环引物啊？

细胞海洋

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