请教mi-RNA茎环法设计引物

mckf111

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( E# m1 K* V. I7 Y5 Z. Q. g# c' `+ u0 B* ~* ?! `, z; W
5S也可以做内参么 人和鼠可以共用同一引物扩吗
) F- E  H' B: w6 C; c引物序列是什么 还烦请指教

mckf111

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4 Y/ z& V5 `4 r* Y. d3 k$ _# N$ O" m. Z1 {" @
应该是5'-GCCCGC再加上15bp左右miR的5'端序列 注意把U改成T

王乾

我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA，我们设计了三条引物：一条反向引物用于反转录，一条正向引物，还有一条通用的反向引物，同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补，而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt，其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分，而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。
, O" F$ r5 b& O& o" T

gunther

"而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度"
9 z9 W0 E" v6 X  h% W是这样吗？3 m6 Z- X& o3 u) k( n9 c
所以forward前面的4~6个nt序列总是不一样。
, R9 I, o0 p) Q  d, w3 V
4 Y) w* d/ {5 w$ ]: lsunsong最后找到答案了吗？我也想知道！

gunther

4 U: y$ f4 Z" h$ Z; r/ }我看文献好像前面那段并不是通用序列，不同mir的forward都不一样，真的仅仅是为了改变TM值吗？7 E% e" \+ e0 B, W6 ]; W. s

( }+ \5 X+ v1 m  G+ {另外，为什么前面一定要多一段序列呢？
# T1 U6 [) \0 L. @

runsong

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6 }1 Y  y* n- c
6 H" ~( q: j/ n" k' C% f+ b1 {我最后没有按照王乾说的做，在设计上游引物时我只是在前面随意加上几个碱基，让整个引物的GC%平衡，退火温度在63——65度之间就行了，没什么问题。; g1 I9 c9 l8 k% [: n
其实应该注意的是反转录引物与上游引物之间不要有大于2bp的交叉。否则因为做完反转录后反转录引物的浓度依然很高，用这做PCR的话很容易会将反转录引物作为模板扩出来。我有过这样的教训。

runsong

回复 gunther 的帖子" e1 |: O6 i6 M# }/ S3 v6 V( i6 R7 P
' @$ Y5 y8 U$ V" a( V
不同mir的forward的确都不一样，而且反转录引物也几乎都不一样。* B" ?! o7 a' u' U
forward的主体其实就是被反转录引物占用6-8bp后mirna剩下的前面那一部分，当然也可以向后延伸1-2bp与反转录引物重叠，在前面我也会加上几个碱基，其理由我感觉就是为了改变TM值，与下游引物匹配。+ Y  l! z; w8 B- W8 d
这套系统的原则是：扩增MIRNA的特异性是通过准特异性反转录与特异性PCR两步实现的，这一点在扩增同一家族的MIRNA时尤为重要。要自己好好体会。: n. B0 P( l& y3 X1 \5 {4 A$ E) {/ A
/ V2 b1 ~+ i+ {: F9 m
呵呵，其实都是我自己一个人的观点，仅供参考。

wolf1978

我的建议：进行miRNA引物的设计具有一定的难度，与常规的引物设计差别较大，不是每个都能成功。最好能够选用公司现成的一些产品，包括TaqMan探针、burgle stem-loop引物等等，节省时间，把握性更大！

foodmic

如何设计特异的茎环引物啊？

细胞海洋

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) P8 C  D2 \$ I" {: Z3 t! d+ l+ u
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