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求助双酶切的问题   [复制链接]

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楼主
发表于 2011-4-8 09:07 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
我用双酶切speⅠEcoRⅠ 双酶切,但是这两个酶切位点紧挨着,切了一会儿没切开,有没有人提提建议啊,该怎么办呢?谢谢了
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沙发
发表于 2011-4-8 09:23 |只看该作者
这两个酶切位点要是离得很近的话是不能用这两个酶切的    他们中间最少要有6-10个碱基   我建议你重新找酶切位点
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藤椅
发表于 2011-4-8 09:24 |只看该作者
你所指的切了一会是多长时间 10分钟 还是1小时  ?7 ~3 J5 j' f0 K& |
我们一般酶切的时间按是1到3个小时之间哈  只要EcoRI 和SpeI两个的酶切位点没有重复哪怕只相隔一个碱基都能切开哈。
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板凳
发表于 2011-4-8 09:55 |只看该作者
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酶用的是哪个公司的呢,NEB的还是Femertens,还是用好公司的酶,双酶切不成问题的% d" i9 O8 x' C+ C* e
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发表于 2011-4-8 10:19 |只看该作者
分步酶切,必要去磷酸化
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地板
发表于 2011-4-8 21:48 |只看该作者
回复 274996064 的帖子
8 W7 O. l5 W/ ?9 Z' C' {, j  n
& D$ H4 L: k$ b/ o( a3 ^3 U3 i( m. c前面都做了好多了,重新找就得返工了,我先用EcoRⅠ切了10小时再往体系里加speⅠ,又切了5个小时,在用CIAP处理,这样可以吗

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发表于 2011-4-8 21:49 |只看该作者
回复 ljzmy82 的帖子; ]" j6 A- p7 P, P4 \: E" n
6 o# L3 s5 U+ V: |
都是NEB的酶

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发表于 2011-4-8 21:51 |只看该作者
回复 jun8013 的帖子$ M8 j) d* J) q
% e1 A- f% t! X  P" O
我先用EcoRⅠ切了10小时再往体系里加speⅠ,又切了5个小时,在用CIAP处理,NEB的酶里这两个酶有公用buffer的,用EcoRⅠbuffer.

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发表于 2011-4-8 22:29 |只看该作者
回复 军医 的帖子* o- g7 @. R# B! F( o

) V1 Q2 _! K7 u6 z  a7 W如果两个酶的buffer相同的,即可共用的话 你可以将两个酶同时加入,不用一个一个的加入,; B/ S6 a4 z" f: N
还有就是酶切的温度  通常是37℃或30℃。
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发表于 2011-4-8 22:35 |只看该作者
回复 军医 的帖子' g3 \' I4 n. D

2 H% J2 f1 F; s  u% M如果两个酶的buffer相同的,即可共用的话 你可以将两个酶同时加入,不用一个一个的加入,# @" D2 O2 ]& T5 g
还有就是酶切的温度  通常是37℃或30℃。
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