求助，关于Ki67免疫荧光染色的问题

听不到

  对pc3细胞做Ki67免疫荧光染色，但是怎么染，Ki67都是胞浆着色。我查了下，Ki67是核蛋白，应该就是核显色才对啊。我上网查了下，好多人也是出现这样的问题，然而并没找到解决方法。我的整个流程是这样：
9 P  p6 i% R1 N; Y# k* q' C- V细胞多聚甲醛固定0.5h，0.5%triton打孔0.5h，pbs洗，BSA封闭1h，Ki67在4度孵育过夜，pbs洗，二抗室温避光孵育1h，pbs洗，DAPI室温孵育0.5h，pbs洗，甘油封片，荧光显微镜观察。我对于免疫荧光已经做过很多次了，自认为没有什么手法问题。希望有大神可以帮解决下。
( \+ ~+ V" u5 F/ z9 O  h+ C: L下面是我做的片子：
+ l: k1 j  \9 v8 z7 K

2016-3-9 22:19 上传

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ki67

2016-3-9 22:19 上传

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dapi

听不到

忘说了，红色荧光是ki67，蓝色是dapi

顺其自然

可以看出第一张Ki67的荧光图片背景很脏，所以，我猜测是否因为一抗的浓度过高引起的啊，因为可以看到除了胞浆强荧光外，胞核其实也有部分荧光信号的，估计那就是你要检测的Ki67,但由于一抗浓度过高，导致胞浆着色很强。$ E; F5 V0 }1 H" p! I$ U2 \
个人观点，仅供参考，欢迎讨论！

听不到

回复 顺其自然 的帖子% y) q/ k6 P' G" O) M$ n4 ^

0 m) |+ d+ x8 O- W感谢，总算有人回复了，我一抗按1:200稀释的，不过是按说明书来稀释的，但是我想的是如果一抗再稀释些的话，那会不会只染了胞浆呢，不过我还是试试吧也，谢谢啦~

cneagle66

同求

biovictor

回复 听不到 的帖子# l  Q* Z9 U2 T

: {3 ~! t0 Q* L# a请问楼主是石蜡切片还是冰冻切片？如果是石蜡切片的话，楼主就要注意抗原修复的方法了，如果用的柠檬酸盐水煮法，可以换成EDTA处理，或者蛋白酶消化处理。仅供参考。

听不到

回复 biovictor 的帖子) g, p2 p  K7 z6 k$ B

+ h2 ^/ ], @/ n% i# Z3 f% Z0 M我是直接细胞长好后用多聚甲醛固定的，理论上不用抗原修复

biovictor

回复 听不到 的帖子& d+ W! T3 g2 h0 G( X

# w+ a' U" y& B3 {% _哦，我还以为是切片呢！那就不是抗原的问题，在下认为可能有两个问题：1，有可能是抗体的问题，不知都楼主有木有看看抗体公司的描述？2，Ki67主要在核里，但是在胞质里多多少少有一点儿，因此，比较大的可能是核膜没有打穿，楼主有木有换一种透化液，0.5%TritonX-100浓度有点儿低啊！

听不到

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5 S8 H" W0 N$ ]6 v& W* P
& C. b. G/ X* E) Y5 b0.5%低吗？我看大家用的都是0.1,0.2%的呀。至于这个核膜没打开的事我问了我老师，他说既然细胞膜被打孔了，理论上核膜就也被打孔了，而且貌似核膜本身就是有孔的吧？我现在怀疑是一抗不好使，打算换个一抗

biovictor

回复 听不到 的帖子1 J* l6 t  p' g- l( F# a5 {5 Q
4 v2 e- J/ V, F/ Z2 a* _
嗯嗯，一抗不好使，这是最最最令人无奈的了，加油楼主！