请教一个双酶切的问题

深海寂寞鱼

) }, Z9 A, p3 E+ F' U
! u1 z/ G( Z" b/ m
to sidalin301：; j- N& z1 ^* s% k' v* C# i: B
0 R% _7 G7 j) X' s- e& k9 w
   你的问题描述的并不是太清楚。大致的意思是把目的基因从pUC57质粒上切下来，插入到pNL质粒中。但是因为没有pNL的质粒图谱，所以你担心可能会把序列反向插入，从而使目的基因不能表达。% y0 P. r% z' x6 a& F
3 R9 g/ d# Y: w) f  \9 ?: y
  1. 解决这个问题的关键在于找到pNL质粒的图谱，如果没有图谱，一切都是在猜测之中。
5 e4 _0 P6 z3 [7 |8 m    # y; e, z* d* i# v) e: {4 c
      我试着帮你找了找，在Addgene的网站一共找到了4个相关的质粒。（见下图）8 |' {! ^" v- \" w/ L
      不知道你的质粒具体是其中哪一个？
9 c+ k2 x) s; E! K0 N% h" x; A; o9 P      

2010-10-19 13:11 上传

下载附件 (40.78 KB)

0 K& G( P8 l/ f1 u) V9 L+ E6 @: w* o0 U

* }9 e& o/ |9 h  O6 l2 ^  2. 我把这4个质粒的图谱都看了一下，其中并没有你说的同时存在BamH I和Nhe I的情况，倒是有同时存在BamH I 和 Nde I的情况。% b/ O, D9 k3 |! z; W/ [
      希望你再核对一下你的质粒名称，以及酶切位点。
( O" E2 q0 e( T- S0 j
. A' ^" q3 Z* H+ \  3. 如果你之前提供的信息是对的，那么当你插入你的目的基因后，它一定不会按照你想要的方式表达你的目的基因。目的基因的序列必须和启动子的方向一致，才能得以表达。
$ D- D+ d5 _0 s* h$ `  P- C' d4 @  a1 u5 K, C7 P; y: l) Y
      如果是这样的话，我能想到的一个简单的解决方法，就是用一平一粘的方法把你的目的基因插入pNL质粒。
4 S! P. u3 T( n  q# |/ w+ n; ^+ e: I0 y2 R! J: t- h9 O4 I/ v
      具体的步骤是：
) `5 H, e6 c( h; v) \. ^2 a- Q) R( {* E, I, z7 i7 _; R0 l2 g
      a.用合适的酶把pUC57质粒和pNL质粒分别线性化； b.用klenow酶把切开的质粒进行平末端化；c. 用BamH I把平末端化好的质粒酶切，产生粘性末端；$ M- e0 o; m# T8 O5 H8 W, p
! D2 P# X8 p0 c. V/ |4 g7 K0 c
      d.然后分别回收你想要的片段进行连接。  v1 P3 Q2 o. |" b6 T% G. O6 H7 i

  t; e: s& _8 e3 S, @     这样就可以把目的基因正向插入到pNL载体中了。
" Y% T) s: [; I9 T9 q: O( o
$ H8 c( O8 Q( w    这只是我自己的一点想法，希望别的战友也能一起帮帮忙。

djj01

如果有起始密码，反向表达的多肽序列也是无意义的。。。

sidalin301

回复 11# 深海寂寞鱼 ) P8 d- j, h& y# a0 p! f* L4 K

% P5 l3 I9 E$ H6 \" e0 U- p' H! E! f9 }; Q% L
    太感谢你了！想不到你这么热情，我很感动！

sidalin301

回复 11# 深海寂寞鱼 $ {' j9 }$ Z+ J8 X' j. a* b# u! I
: B$ P" G' \2 R% B7 @* ]4 c

) o1 _3 Q- F) c- E6 L    能把你的联系方式如QQ告诉我吗？我想以后请教就方便了！

sidalin301

反正就2种结果，方向相反和不相反，我先接上看会不会表达再说，如果不会就是反了，再从新接。
( _+ a. e6 k2 G$ ?谢谢大家的热心帮助！

shiqingxi

选的酶不同应该是不会顺序相反的，质粒构建完成后，需要鉴定，测序什么的应该可以避免你这种问题的。