- 积分
- 0
- 威望
- 0
- 包包
- 0
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1、引物、探针的设计:7 ~8 S& H& U8 U8 N
探针Tm为68-70℃ ,<30 bp, 5’不能有G,G可能会淬灭荧光素,
- o$ Q! g8 a! G) Q 引物尽量靠近探针,扩增片段<400 bp,引物Tm为59-60℃
; {5 b; V* }" H( k" _ N0 B. V8 e9 @# Y& h n3 v
2、反应参数的确定:
7 u6 s. p2 `3 ^+ x+ a7 A 一般为:94 ℃,10-20S
a) S7 i( b' z* g I: m 60℃,30-60S(Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高),也可通过温度梯度优化退火温度
7 C) [8 [1 |' n" ~ 7 c3 e! V% D7 g7 [" l0 u) H% w) m
3、优化引物和探针浓度:获得最小Ct值,最大信号/背景比值5 c7 k3 l' T# ]1 f9 w/ y0 m
引物浓度:50-900nM
1 C7 S5 t+ s) h7 f1 Q# {6 z 探针浓度:50-250nM
) f% ~0 c% G- J, i+ L% x |
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