关于克隆效率问题

songzxj

各位研究员：
( m* E- s! A5 N: u; q2 `& C$ y/ C4 }    本人最近一直在思考一个问题，那就是克隆的效率还能提多高？最终能不能达到体外受精的效率呢？请各位研究员发表您的见解。

ambassador

douhw 发表于 2011-1-15 16:50   s8 P( u2 |- F
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. P& L* s- p; p+ N9 I% J2 F- B% x此两个阶段仅是设想，还需论证和不断地摸索。也就谈不上特殊的培养基和因子了。

9 ?4 K4 k' ]6 Q5 u
我们的成熟培养液是用NCSU-23（无BSA），感觉里面添加的东西还是比较重要的（10%pFF+10IU/mL hCG+10IU/mL PMSG+ 0.1mg/mL L-半胱氨酸+10ng/mL EGF）。

douhw

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7 e$ W4 ~7 x6 z+ i# O- M
此两个阶段仅是设想，还需论证和不断地摸索。也就谈不上特殊的培养基和因子了。2 h. O; ^0 R3 M& u& L

" p  T1 h0 |. ^2 Z3 M谢谢指教！有好的建议新的方法请多分享！

ambassador

douhw 发表于 2011-1-13 18:45 2 f5 C% u4 ^- N; @) T( N; |& v; n
回复 ambassador 的帖子& P7 r: p4 j  o9 e2 y

, Z- i5 _* ]6 M其实我认为，透明带的缺失、以及如在制作嵌合体方面等都存在与显微注射相比较的不 ...

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您所说的，“尚未付诸实施”是指你们在这两个阶段都没有经过特殊处理（只是去核用手工，重构胚呢），只是用到常规的方法？有没有特殊的培养基或者加入特殊的因子？

douhw

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$ S6 o$ N  C+ h9 ^0 H0 \
其实我认为，透明带的缺失、以及如在制作嵌合体方面等都存在与显微注射相比较的不足。- B7 \1 l5 @/ J

, N: Z5 W- B2 t! R; j而且关于重合编程，我认为融合前对卵母细胞的处理即去核阶段，融合后对重构胚的处理是最重要的处理阶段，以为此时供体细胞与卵胞质融合而编程开启。但是，尚未付诸实施。

ambassador

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douhw 发表于 2011-1-11 09:55
; \" j. W+ j' E4 w4 u0 y9 [回复 songzxj 的帖子! r6 v$ K/ J) ]3 d- ^$ t
4 q4 t# m4 F' q. F
HMC也有自身的长处与不足，但总体来说，效率换好。我所做的动物是猪。

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) a, x  Z# f3 Q( a我个人觉得不足之处是需要提供大量的卵母细胞（这个在大型猪场可以提供，也就不是问题了），其他的不足之处，还请多指教？
: @4 C: ?1 S6 Z) K' B+ W: S1 v) q# @+ L) K
还有在重编程最重要的处理阶段，融合前是只对受体细胞（去核的卵母细胞）进行处理？融合后的体外成熟除了常规的方法外是如何处理？

douhw

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8 i5 C( f7 q0 w8 i0 D+ h  DHMC也有自身的长处与不足，但总体来说，效率换好。我所做的动物是猪。
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我觉着，重编程最重要的处理阶段是在融合前后，因为在体细胞进入卵胞质、融合后，重编程便开始了。

张也行

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5 V' L' X8 ]  o5 j* X6 u$ a& g* r% M( p. j. \" N6 H% t: }! s" v

" d. J7 s2 B# H/ u

你觉得是这些发现还不足以提高克隆效率还是yamanaka等人专注于IPS的诱导而忽视了克隆？我觉得可能的原因还是前者。

4 W; p1 o! h8 {% u; @我觉得也不是。在成熟的MII期的卵子中是有这些因子。虽然Yamanaka曾在文献中说iPS灵感来自核移植，但是iPS最初是从ES特异性的基因库中筛选出来的，分离出来的是因子都是与多能性相关的关键因子。但是，我觉得我们不应该吧核移植得到的一个完整的胚胎，也就是说核移植获得的是全能型的细胞（totipotent），从发育的囊胚中分离出了ES细胞。而四个因子诱导的iPS细胞是多能性的（pluripotent）。核移植获得的融合胚胎能生长到囊胚阶段，从中分离出来的ES细胞（NT-ES）与正常fertilize，分离出来的ES更接近也就容易接受了。! ~& M  s) h9 j7 \4 @
所以，iPS应该更多的向核移植“学习”，比如周琪和高绍荣都试过分析成熟卵子中的蛋白质以期望获得更多，更关键的重编程因子。

songzxj

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, t# D# Q8 I1 b1 }' R# \& N( a9 a* i不好意思，我其实是不看好HMC的，可能是偏见吧。不过它在牛的应用上真的很成功。
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6 k6 L3 a1 [. u请问你做的是什么动物？第四周检测怀孕率，猪吗？
3 s0 r1 H: o% h/ `/ w' {" U: N% s  ^* C+ v4 O
怀孕中期吸收的现象是很多克隆动物共有的问题了，这个追根溯源应该还是重编程不完全造成的，所以说体外囊胚率高并不一定胚胎质量好，它只是其中一个参数。
( X- o# m. U1 b: I, o. y! ^  D
/ y  Y! T3 W$ O% V+ [解决重编程问题的途径不外乎那么几个时间点：供体细胞、早期胚胎和囊胚期。但是前两个时期算是预防的话，那囊胚期只能算是补救治疗了，因为那个时候胚胎已经由多潜能细胞期重新进入分化过程。

songzxj

回复 张也行 的帖子( J1 S! Z  u' r' f6 J. @

" f. _5 D4 L$ {) w谢谢！4 M$ l3 M% j+ P, a' g
非常赞同你的一些观点，核移植效率要比IPS的效率要高，且NTES比IPS更接近ES细胞（这是去年一nature paper求证过的）。
8 n( O/ }+ n* I5 L5 ~9 U) a# G8 ?# O9 t6 [' Y4 X
我们知道四因子发现源于卵子的重编程（或者细胞融合过程的重编程，我不确定），但是这些发现却没有应用于克隆效率的改进！你觉得是这些发现还不足以提高克隆效率还是yamanaka等人专注于IPS的诱导而忽视了克隆？我觉得可能的原因还是前者。# m! b* }" B+ c7 ]+ j8 M

8 z" q9 g, |: b5 s9 P& W) U所以我想IPS中有效的因子对于提高效率可能并不起作用。