又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

: E- w3 \( f: Q+ m( a
# R9 ?2 E- u3 a/ P( S( i在此省略实验试剂和仪器设备步骤# q( Z! d  X) s; e3 I* S
成纤维细胞的制备- x5 e, k6 E! D2 Q
1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies0 @4 R" G" f/ ?1 ~
A 时间：15d  R0 N. k8 v' Y# L0 a  Y; [) }
（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
: \% t- E  N2 ~7 ~9 S（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
: }2 F- I' t- S# \0 Y（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
( `" I7 j& V/ O# |$ @（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
1 ^6 ]5 y5 }2 _' R& Q3 X（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
( U6 O  v  ^# K$ B% Y+ p（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。6 o1 n' H- m% E8 ?0 Z
（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)6 E, L1 _0 x- Q
（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。6 M7 V7 W! X# \! X
（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and; Z$ [3 |# q0 r, l$ S3 `3 K
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
8 H5 u+ w, ^) f6 x& a  X( g6 s3 K" r  C# y: b' T
尾尖（B）时间：10d$ m  _: L' A3 p3 i7 h
在此略
2 N1 o# i  \6 C% u" w; d解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h/ V& ?' n2 _1 i2 e3 k- g
（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
8 Y. L& [8 f- |& D9 X（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
& o  P8 @9 \$ C# z  K- y（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
; i, _+ O% q3 o) ~（4）        160g 离心5 min，弃上清3 ?5 H: B" T' H. @
（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
' _8 O9 W' a5 c# c# A: |6 l+ L孵育，直到达到80–90%汇合& j+ f2 t, g9 w+ O( B

1 J) {  r" W9 S. D& g, C( lCRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。/ N6 h( F( }) f$ Q4 R, X. b' L( F

( e: A& w: Y( `2 F0 Y; J$ {: h1 C2 DSNL cells的传代 time：0.5h
( T, a- E/ c& Z* {6 ^1 A（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次
$ N3 G; ]/ e& D5 y2 u% W6 ], E（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min) R3 D8 P2 I  c  @9 a# O8 u
（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
. Q( `, }: B  ]; p+ n: X. N（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage2 e* n" }& ^$ K; }

1 _4 C7 }/ R9 M" UMitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h4 T9 A% T' N! @- K  D
（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1/ k3 p# ^2 g1 a/ h5 J4 D4 ~/ ?% e
（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
! _1 A- E6 G0 S9 k$ h（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
1 t: S8 V! P# K（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)( N. g" v/ |$ P5 X5 S
（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
2 i4 T# {. i5 C; C0 `PAUSE POINT" |5 \' q/ Y' C9 F
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
$ E9 a; j, P3 v: j
$ u1 j0 y  I! }/ C0 Q' \7 z6 V# _; ~6 Y解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
, ~7 A5 Q0 D- a1 P, M% ?+ C$ [（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中
0 r& n+ z  U! b# v+ }. j, i, L（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
* I5 K6 j8 N1 @$ ]" j（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
# Q% y' s4 X  y+ m) p' ^" h2 f" I（4）        160g 离心5 min，弃上清1 N2 ]( H  o. e0 }
（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育/ m6 U% {  i$ j) t* K2 E. d
（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
; f5 d! r: |3 [  m: M8 q6 D8 i1 S) t
Plat-E cells传代  TIMING  0.5h, i- G" Z9 k( |3 T' [! p7 Y
（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清
: [. A3 C5 L/ O' ?1 a7 L3 ]  w0 u（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
! B0 ^, f' ^$ ^Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h" Q! g* s; @" s
（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
  l5 _+ J+ x6 r  Q/ }( m（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
" I, D. l1 @0 L' e5 d& a（3）        180g离心5min
; Q+ j4 `# L5 V# ^: ]4 j1 i. X（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮: F' M' @6 m9 o' H! g: Q9 k& U( X
（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml. A3 n# Y9 {; d0 e, a
（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
; k, |. H. ~# S1 e6 u/ H2 vDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h2 H. [/ D1 A( b( G& n3 _0 R' `
（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube$ R% Y+ _# d' l
（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
$ E& I- x& E3 N: w/ w* I! ^. O（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
: I1 S7 E  `4 n: m% b（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜' |4 [! O# m* _! i9 u
3 ?' w+ G4 b9 w! \1 c2 H5 Z
关键步骤3 n* @3 ~6 T8 ^9 o( L/ }
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction# e1 _3 F: G5 A

" ~8 X( `0 r- t% P0 k1 MDay 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h: [8 L+ u: _$ G  y! s
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
+ @7 m* {) D! `/ f% o3 D$ m# kPreparation of fibroblasts  TIMING 1 h2 Q; B, y4 K4 p- I
（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）  }. G" [5 I9 B5 @/ x" @7 f& y
（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗7 h6 R  D: Q  d
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min; Z- `) `: B/ D0 g* w. i- D
（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中+ k% Z# {* y4 H% s% U5 v
（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。# _" V" C. H2 P# d" r
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h6 a; i* A6 O7 m" l6 P* L
（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
! W# X. z& I$ c6 Q4 _& |: P（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1, V  {; s* R. M- x7 e6 q
（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
; \4 k* b/ v$ c" [关键步骤
# p6 c" b& }$ J! L' o- `+ yRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度2 |3 T) Z) \  o0 F3 |

; \! H' V' p3 u6 ^（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜) z4 C7 K; t% G- K0 s8 _
$ N5 y4 y# z& q
Day 5 and 6  TIMING  5 min each day
5 c: |( V2 H  F. Y% d5 c24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS  A1 u7 f5 _( E# ]9 I* ~
Day 7   TIMING  5 min$ F  |* z; d1 s: @/ ?# |
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
: R! B7 w9 p# f' jDay 8–10   TIMING 5 min each day* [8 \3 W2 Y  V3 J  V
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）; U' l. q1 ~  e: q% y
Day 11   TIMING 5 min
3 F. S" |  ?) ]( j5 J% N For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
( K. E( H8 z0 jDay 12   TIMING 约5 min each day/ {6 O  Y5 W8 D& l7 K0 Y
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
" W$ G$ Z3 f. A% BCounting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d2 ~+ q, ~. p4 h6 \, [
（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min) l  T: ]7 E- \: _3 @
（2）        Wash the dishes twice with water.
, K1 o; M, J+ m; G# f) I（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min6 _" Z7 ^+ C6 L( A' Y* w) H4 E
（4）        Wash the dishes with water
, E, P$ @7 w: V* {: ^3 a（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.
; x* G$ F  J/ c0 ?2 |- @
' v/ l5 M7 w, @1 k) WExpansion of iPS cells  TIMING 1 h4 P5 ~& c7 c4 e% ~6 B" j) ?5 Z
（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞! W  A2 l0 J3 k6 ?
（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min9 K4 F6 s& v% Y" }6 L/ X
（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层3 F+ I" a" M1 c
（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
; S. U) o* u, r; ^0 HPreparation of freeze stock   TIMING 1 h& N  `0 E9 B4 @/ y$ O
（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗
; R3 b! m8 G- ?: c7 a（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
2 G# ?. j3 \7 Q2 T5 \（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层5 t9 Y3 H, E4 j! P) y1 D" s1 Z
（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min6 v& O- j$ X6 G0 l
（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
. V0 \+ y( t5 j' t" ?. |8 R' q（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）2 t* Y+ R3 [, i# h. I6 c9 P
（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀: n1 N- O3 L+ I( c
（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）2 J! E6 [3 E( V  k: ?8 t
PAUSE POINT
4 k+ o/ w1 D+ u) @5 mFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank., X" s7 {; F# ?0 i3 t7 @

sunny2829

什么时候的呀？？9 N  v+ O- {. B# Q" Y) A6 {% q) a

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子) P0 V/ b4 _( l8 n; ]
6 A# v2 Q+ m' P8 x
这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子
1 I7 {" {( ~5 x1 W% m, s7 z0 p! j4 T; {. u* f
呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
  e# s" b7 ^! Z* K5 V8 n- k8 c这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
; z, B* x9 i8 T; f$ c4 h- L新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
, v4 m0 V, J' |7 g- ~! ^这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？0 `7 U7 C1 {3 X2 L# W" x8 D- O1 |6 F+ b7 V
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子5 z$ |' ^" j* l+ c" e$ v* N

8 J6 f8 N6 t0 y% y呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是
. n5 F" D3 M  s3 i% l, \首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是9 r5 X$ b" g4 c
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生
' p% n" k5 e9 }9 L9 t# p最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子0 N7 Z; E9 S! p1 [
( D* Y$ D9 p& H$ Z, R9 F' C) J
太感谢啦！！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
- ?; K' p' _6 f: @
9 u! t! n) n" P1 L7 f. S. K+ J没事，相互帮助嘛