请教一下关于wb定量的问题

Jiangshi90

cyz3057 发表于 2015-6-24 21:19 : I  y' t' m& a' _& ^
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恩 好的 那如果测蛋白浓度 还是比值小于1更好一些 请问我用水调零 准不准啊 是不 ...

3 N. R! U; j& T' i9 o" I
如果溶液同时存在核酸时，须同时测定A260和A280,通过计算校正核酸对测定蛋白质含量的干扰作用，有两个公式可供参考：3 V1 I1 @4 O& O; y% z: h* \% m
Lowry-kalckar公式：蛋白浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260" o3 m6 p& {5 [1 _. b
Warburg-christian公式：蛋白浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260

Jiangshi90

另外紫外分光度法测蛋白浓度的原理是蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，其最大吸收波长在280nm，但由于各个蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量是不同的，因此要准确定量的话还是要差点~

Jiangshi90

cyz3057 发表于 2015-6-24 21:19 # N" s$ i- {: z4 c" F
回复 Jiangshi90 的帖子4 s8 J; p1 G8 N. V9 r1 G

8 f- i( b7 o# @2 n! v9 Z恩 好的 那如果测蛋白浓度 还是比值小于1更好一些 请问我用水调零 准不准啊 是不 ...

/ J6 E" P1 J! ^调零的话你可以用水的测一次，用裂解液再测一次，比较下差别大不大，理论上最好用裂解液，但用水应该也是可以的。

cyz3057

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1 a" k9 y- z& _; k' e8 d# r
, A: s+ g) u1 _' b6 K8 Y* P嗯 是的呢，现在越发觉得测浓度很不准。。。直接看内参去调了

edwardellen

买个BCA试剂盒吧，国产碧云天的就很好用，但是要在加上样缓冲液之前检测，不然溴酚蓝干扰，你什么都测不出来。% |( {1 x1 F& B. ^- k$ @4 y6 a
试剂盒很便宜，还有说明书，可详细了。
+ z) b9 ]& O, n5 H- q9 h我们一般上样，蛋白是30微克。

cyz3057

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4 N. p; Z7 c; H4 Y" t
& ^( Z: _8 ]+ n5 \" q嗯 已经这样做了 谢谢哦 加油

zhu1019

我们做westernblot前都是用BCA法测蛋白浓度，直接法紫外分光光度仪测蛋白的浓度的话如果不是纯蛋白是不准确的吧。一般细胞样本都不需要怎么调内参，你铺板的时候细胞数应该差不多的吧。除非你试验处理会影响细胞增殖，否则内参基本一致的。