关于T7E1 Assay的一个疑问

Damon-Salvatore

在网页上看到T7E1 Assay，是用来检测cas9介导的外源基因有没有插入到基因组（动物细胞）相应位置。& Q( X. E8 e' l+ Q5 F
具体protocol见 http://www.tools-biotech.com/image/2014/05/27/20140527101154.pdf8 [* r* h8 c; s4 I- T5 s

* ~4 n4 s6 }# m2 x$ Z如果筛选的某个细胞克隆是杂合子（一个染色体上插入成功了，另外一个没有），最后结果也会出现两条目的条带，和纯合子一样，即最后还是需要测序确认。8 P7 e/ N9 I2 }! j0 \( z
如此一来，直接通过PCR检测岂不是更高效（一个引物在插入的外源基因序列中，另外一个引物在上游或者下游四五百bp处，有条带的话就去测序）？
3 d) U; f+ D6 t0 ~* G- x0 |$ b' y6 N5 m) k( C
还请大家多多指点。

misser217

关注中

hyde

这个方法之前好像都是快速检测KO比较多吧，大片段KI的话还是PCR测序，最后southern，KO是应该不能区分单敲双敲吧，只要退火后两条带组成有gap就会切吧。KI如果两条染色体都是KI了，那不就没有效果了吗？和WT是一样的，两条均一就不会酶切吧+ m  D2 y& B3 \+ X3 w% E

Damon-Salvatore

回复 hyde 的帖子+ q  @, l- b" \+ X2 o

3 h7 i- ]" X7 |& i4 z感觉T7E1 Assay没有办法鉴定KO是单敲还是双敲。但是如果用PCR检测的话，扩增引物在敲除区间外，拿产物测序，一比对就看出来是否敲除了，敲除区间如果是双峰（一个是WT），那就是单敲了。至于KI，用PCR（下游引物放在外源基因上，上游引物放在外源基因上游400bp左右），拿产物测序，也可以比对出是否插入，纯合子还是 杂合子。那T7E1 Assay岂不是费时费力结果还不好？

hyde

反正talen cas9 ZFN最初的那几篇讨论技术效率的都是那这个酶切亮度来看效率的吧，是为了最初确定打靶工具效率的，不是为了建立单一细胞系的吧，即针对一个mix状态的检测，不是单克隆阶段的测试方式

hyde

类似于最初收样品PCR看峰图的杂峰比例，不太适合单克隆鉴定时期的鉴定

hyde

KI的时候可以特异加入一个酶切位点，这个比测序要快一点

Damon-Salvatore

回复 hyde 的帖子! s8 R$ I/ z1 i7 l$ Y( A/ x

2 B, P' W$ X; h# R原来如此 多谢指点

winstonsee

学习中

niliu730323143

KI确实可以通过PCR检测，T7检测indel比较多。