造血干细胞流式检测结果分析

SKC-SFC

各位大侠，我们实验室目前在做造血干细胞的鉴定。采用流式细胞仪检测，选择的标志物是CD34+CD45+CD133.* R+ E5 }; a$ n- ]3 H. R) G
方法是：标记去红后，用CD45/SSC画R1门，圈定白细胞-画CD34/SSC双参数图，显示R1门，画R2,-建立CD45/SSC双参数图，显示R2门，画R3门-建立FSC/SSC散点图，显示R3画R4门-回到R1门所在图，选择CD45阳性最强和SSC最大的位置画R5门-重新确立R4门的位置-画CD34/CD45&CD45+CD133双参数的十字门，确定R1门的临界位置来重新确定R3的位置。
$ p5 L9 _" R* z8 Z- |7 c不明白的地方：& J5 J& ]' d5 o5 N1 S1 l
1.CD133的必要性
, ?  J, }$ s7 Y9 }+ R2.最终造血干细胞的统计学数据是R3还是R4的统计学数据？
- _1 t1 i! f6 u. X) l3 O* T3.通过R5门来重新确定R4门作用在哪里？
9 _3 K+ F; z/ C+ \+ h4.我的这个实验思路无问题, S+ X; c6 k$ ^5 A$ F/ ?
求各位大侠指点，谢谢！" ]! B2 t6 t" T+ v3 V7 J+ l
   

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顶起

nailute1985

1、cd133必要性不是很强，造血干的特异性标记就是cd34+ 所以用双标就可以了。+ Y) r7 ?6 |: g; W/ V* u
2、你用的是十字门吧？但是我们做造血干的标记的话是用的逻辑门，大体上是这样的：首先ssc／cd45设门圈有核R1，然后R1里面做cd34+／ssc 圈cd34强阳为R2，然后R2里面做cd45/ssc 圈弱阳cd45为r3，然后r3里面做fsc／ssc 圈弱ssc那部分为r4，r4就是结果。" G. Y5 F: c) J- g* Y% J% m- b& x
3、楼主选的是强阳性的cd45吗？我觉得应该在cd34＋细胞群中找到弱cd45的 那才是真正的造血干，并且在ssc／fsc中也要找出ssc弱的那部分。

SKC-SFC

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$ l1 G0 D$ K( z首先要谢谢您的回复。
$ h2 G! O  j' }. h  U1.选择CD133是老板的意思，因为国外不少文献说，CD34-的那部分细胞也具有造血功能，而且不少国外文献有把CD133加入和协助鉴定造血干细胞。. {' ^. g3 w# ^! q2 K4 W, y8 F/ T
2.我们这边也是把CD34+中找CD45弱阳性的那群。
$ Q) H4 `- V0 z1 E# c9 \3.您说您觉得R4就是结果，我一直觉得R3是结果。因为R4不是为了验证这群细胞是否落在幼稚的淋巴群中，只是为了验证？" `0 F  Y5 u! T: w( M
4.建立FSC/SSC双参数图的真正意义在哪里？
* T8 D' O6 z2 @9 b/ N% h" ]5.设立十字门的目的又对整个结果起啥作用。从实验设计来看，设立CD34+CD45的双参数十字门是为调整R3的位置来设置的哦。4 I$ a0 y& P& @8 K% m( W
6.关于R5门的画定，有时候左边的杂细胞群挺多，R5的位置不是那么好花，很担心是把单核细胞群画进去了。

nailute1985

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- j3 }! U% g6 ?1 [
1、你们是研究，我们是临床，所以肯定成本我们会考虑进去，cd133成本会高很多。其实绝大部分的造血干都会表达cd34，剩下的只是极小一部分
4 i, l! J, }& ^3、R3可以基本确定，R4的用意确实是为了验证这群细胞是否在淋巴群里，但是我觉得r4是很有必要的，因为如果你看r4的流式图的话，会发现r4的范围很宽，所以最后圈r4还是有必要的。不能全圈上，不太准。
) n& p+ N6 F0 W/ T4、fsc／ssc这个是必须的，无论做哪个标记。这个就是最直观的看三系分区的状态的。8 `# A4 Y$ i' X  h  F# s# ~1 }" Z( j
5、其实十字门也不是不可以，但是对于逻辑门来说更合适，十字门分区并不是很准确，会有压线那种情况，不好区分。* k+ z2 q0 x5 A9 j- U
6、这个是比较常见的状态，因为这跟你去红去的干净不干净，或者血液本身的质量有很大关系。

SKC-SFC

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  N. b( ^, V5 i: `8 X, l5 E
6 }9 g: ?2 @( n6 r% r) Y1.我们也是临床，只是老板希望我们先累计CD133的数据，通过将CD34+和CD133+的数据进行统计学的分析，若无差异的话，就可以采取CD34+CD45直接进行标记检测并分析。
1 y) G  c+ H8 |, L2.从您表达的意思来看，造血干细胞应该具备以下几个条件：CD34+，CD45弱阳性，这群细胞是位于幼稚淋巴细胞群里？
( r2 w) O: ?8 R: P3.我们画R4门，就是在FSC/SSC的散点图中画的。5 A6 ^! }4 k# ^
4.关于十字门我赞同您的意见。但文献都这么做，不知道是为什么？
0 x/ [% ~" V% E* K% z+ Q5.我们去红还算是非常的干净，有时候做出的我图和文献上一致，结果也好分析，有时候回有左侧拖尾的情况，我们一般是通过调大阈值来去除干扰。因为我们的设备不需要调电压。& V( s; e1 j8 h$ Y
6.最后咨询一下CD34+CD45+CD133做同型对照的实验设计.
4 I! X0 m! H3 I# R谢谢！

nailute1985

2、并不是cd34+和cd45弱阳，而是cd34+与cd45+的那一群圈出来之后，相对再找出cd45弱阳的那些。对，位于幼淋那片( r+ `8 W# A  k: D* f7 Z
4、十字门在文献中很直观，直接就能看出来双阳或其他的，不像逻辑门，还得一步步分析，文献中是没办法解释的。
, R4 p# i  w# {  @! t1 I6、isotype的话，很简单，不就是要去除非特异性的么，所以只要把cd34和cd133换成同性对照就ok了。cd45依然做阳性管
5 @8 B0 S" ~  r+ ^8 y8 r

fm100200

学习了

SKC-SFC

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& g; B0 V3 N. j( c* ]0 O/ F( O4 M
谢谢.

yuanyecat

上图啊没图没真相啊