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[请教] 【跪求流式大神】分选的流式图总是shift

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金话筒 优秀会员

发表于 2015-3-9 11:12 |显示全部帖子
本帖最后由 w343989328 于 2015-3-9 11:12 编辑
& J; e! H3 l+ H; }
# ^2 k1 @( S. X/ n( I8 K; Q先说一下我实验的一些情况,我要从组织中分选一类细胞,两个表面抗原,一个正筛一个负筛。用的都是间标的抗体,杂一二抗。
7 v; h' I/ l" q' P' lA抗体来源于大鼠,连着生物素的单抗,用Alexa Fluor 488标记的链霉素作为二抗;+ j" k- v* F4 D% D. F
B抗体为兔多抗,我用donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555作为二抗。/ x2 P+ v3 ]/ T  P0 s( k& o0 U- ^
学校的流式分选仪器是BD的AriaII,有358nm, 488nm, 633nm三种激发光,因此我这两个抗体只能选择488来激发。
4 [0 {- {  |8 ~+ X5 s& t% l0 W: _5 X: V9 A
实验的步骤大概是这样子:组织经胰酶+DNase消化,过滤得到单细胞悬液,镜检、计数。调整细胞浓度到1*10^7cells/ml,加入抗体。冰上同时孵育两个一抗一小时,洗两次,敷二抗半小时,洗两次,上流式前5min加入Hoechst33342,以便在区分掉死细胞。' }6 M- Q; V- j( k1 G# `
/ y# b# b1 M7 ~+ z
以下是几次重复的结果:. L, P" p- f7 S0 Y
1.jpg

! U# Y8 `$ P. c首先是control组,不知道上头那坨东西是什么细胞(肯定不是死细胞,而且我抗体也不会加错),几次重复都或多或少有这么一群东西;
- q& V; p1 w( m$ b8 f其次,FITC通道勉强能有一群细胞出来,但是整个population,包括nagetive cells,都往右偏;
: _9 V  H3 k* J而PE通道则整个群往上走,导致我没法分出细胞群。2 Y9 c9 @' I7 _$ ~( c1 `3 M
2.jpg
7 s3 y6 h/ r; V# f
这次结果好很多了,单独PE通道能分出群,但是一旦加入A抗体,则整个群依然往右shift。我这里要强调的是,基本上这个领域内所有的文献都报道这两个抗原属于两种细胞,而且我自己IF的结果也显示两种荧光并不merge,所以这里理论上不存在说细胞同时表达两种抗原的可能。
' a  J$ m3 b2 t* D+ i但是呢,加入A抗体后,基本所有的细胞都会往右shift,所以将PE阳性的细胞带出我用control框出来的门P4。我个人觉得这里应该不能用补偿把细胞往左调吧?  H. G3 Z, d' N
3.jpg
. I# V+ f8 K- m2 T. x8 U! P
我重复了一次,和第二次的结果一样,细胞都是往右偏。+ `+ Y" O1 e: o# E

8 l; Z6 r8 a  E( N( y一开始怀疑A抗体浓度过高或者孵育时间太久,但是减少浓度或者时间并没能改善结果。
% P( m% @* b2 S8 A7 W# v! G
9 K- a8 p( Z$ Q) d1 |7 _不知道有没有大神能帮忙解惑,不胜感激!
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发表于 2015-3-9 11:26 |显示全部帖子
1. 重做荧光补偿) ]6 v6 c6 v  y' i
  T2 [% p$ q3 W/ I! j# m
2. 洗涤流式细胞仪液路系统6 K2 n, H, l( D

4 _" U- E* c# J8 \6 Z) V6 z个人建议,不一定对。
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发表于 2015-3-9 11:37 |显示全部帖子
回复 mantianfeiyun 的帖子. i4 }3 I0 r& v/ {  k2 m& C/ m
. t. d, x" F6 j2 t( a) A& e- \7 I+ f! d
上面的图都是没有设置补偿的。
' u0 |* ]" G/ p有一点我不是很明白,我这样只是单个通道的shift,这样调补偿没有意义吧?
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发表于 2015-3-9 12:34 |显示全部帖子
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单标,不需要补偿。1 G0 u4 t2 v  ^/ H8 m
FLOWcheck、FLOWset都做过,没问题吧?! ?- E4 K+ a' f% K
你检查下你的数据采集时间,是否跟你的上样浓度符合——比如上样量为80-100万个细胞,体积300-500ul,那么数据采集速度大致在500-700个/秒,搜集1万个数据也就10来秒的时间。如果采集时间为30-40秒,那就是有很多数据都被仪器当噪音屏蔽了,说白点就是FS阈值设定高了,你当前分析的都是些肥胖细胞,所以图形shift。贝克曼的仪器一般默认是100,BD的不知道,你将它设定低点,再检测。
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发表于 2015-3-9 15:12 |显示全部帖子
回复 dollar007 的帖子% d" d6 O' B& K
5 e& M& d# V! Z- T" V! S
谢谢您。您说的FS阈值是指什么呢?
8 a4 k6 |: v4 o! ?" f4 _. _我用FSC SSC框下来的细胞是同一群,我不是很明白您说的肥胖细胞是指。。。
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发表于 2015-3-9 17:06 |显示全部帖子
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发表于 2015-3-9 21:28 |显示全部帖子
求大神。。

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发表于 2015-3-9 21:41 |显示全部帖子
流式通常用FS设阈值,贝克曼的通常这个值是100,即FS=100.仪器默认FS值小于100的信号为噪音信号,不纳入分析。初设定参数时,如果不清楚此细胞的特性,我们通常把阈值由低调到高,调到什么值合适呢——调到FS/SS散点图左下角能略看到一些碎片即可。如果阈值设定过高,那么碎片群你图上看不见,同样的有部分细胞信号也被屏蔽了。我以前做CIK双阳检测的时候发现的这个问题,上样量与检测速度不匹配,后来发现是这个问题,阈值采用机器默认的FS=100,在当时的电压下,80-90%的细胞都被漏检了(被仪器屏蔽了,认为是噪音。)当我把FS调整为50的时候,这部分数据才得以在图上显现出来。“肥胖”细胞是我做MSC时爱用的口语,通常MSC“干性”好时,细胞很幼稚、细小,表现为FS和SS值都很小,而一旦MSC成熟或者衰老时,细胞会变得很扁平、肥大,此时FS和SS值都很高。通常而言,肥大细胞即尺寸大,内容物更复杂、丰富,表现为FS/SS值更高,更易被检测出。0 {# I8 i; q6 k! |* p6 Y/ X( @0 L
希望对你的实验有帮助。
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发表于 2015-3-10 09:20 |显示全部帖子
和机器 补偿什么的没有关系 是细胞本身的原因 你做的应该是上皮类细胞 如果是血液系统一般就不会
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发表于 2015-3-10 10:07 |显示全部帖子
回复 dollar007 的帖子8 ~( u( u$ ?2 T9 U5 `
$ |$ @  |0 i2 d
谢谢你!可是我觉得这里的shift跟SSC FSC两个参数没太大关系啊。
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