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求助:我的CIK怎么了?

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发表于 2012-11-28 16:35 |显示全部帖子
     最近养CIK连续一周了,分血后细胞计数存有大量黑色小点,反光,个人怀疑是血小板。培养几天后,有的瓶子,黑点越来越多,贴壁居多。四五天后,贴壁主要是黑点,养的CIK细胞死的很多,扩增很少。请问谁知道怎么回事啊?
2 b; o; R1 k1 d  分血了8份血了,都有这个情况。是个人操作吗?  那为啥以前没有呢?还有最近发现离心机离心后,就是吸白膜层的时候,发现白膜层下的FICOLL是红色的,以前一直是白色的。是FICOLL的原因吗,最近用的是新批号的。- {/ V8 E' H( r1 t3 E1 O' S7 e* ]1 V; k
  " x, a6 J2 _/ l7 w8 @

8 G) b( ?* @! t0 D   具体描述黑点:细胞计数时,不是用台酚蓝染色吗,绝大数CIK细胞体积较大,但是其间存有少量体积小的也是很亮的细胞。当混悬细胞培养时,在奥林巴斯倒置显微镜下观察,10乘20倍像素下观察,显黑色,但是调节粗螺旋和西螺旋观看,可发现黑点也反光。   做了各项物质的内毒和革兰氏检测,无菌也做了,都没问题?2 H0 F3 {8 h. I, m
   原因何在啊?& [% o, c2 Q) ?% A

* }4 m- [) A. e4 h1 T! \# C: d* n" s  E( Y4 q  ?7 t! V1 S5 S

( _7 X6 L- X) f+ l) a0 V) z  元芳,此事你怎么看?  
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发表于 2012-11-28 16:40 |显示全部帖子
顺便提一句,11月14日 ,本人清理了一下孵化箱,用纯化水加苯扎溴铵,清洗了一下孵化箱,于是从11月15日,噩梦开始。
$ o$ C* ?- U6 R% J4 u8 @' j
: Z! _; f3 z) {+ `" j! F% C7 M. ~2 x后来于11月22日,又重新清理了一下孵化箱,27号分血,今天28号观察还是有,可是有意思的是,一瓶多点,开始贴壁,一瓶很少。顺便说一下,先头分血的,有的丢了,有的加因子处理,扩瓶了,后来细胞长起来的,黑点越来越少;而黑点多的,现在细胞很少,瓶底成了黑色的海洋。
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发表于 2012-11-29 09:37 |显示全部帖子
发图片上来看看

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发表于 2012-11-30 11:47 |显示全部帖子
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白膜层下面的ficoll成红色,如果每份血都成红色,应该是分离液的问题,如果个别血样成红色,应该是样本差异的问题。
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发表于 2012-11-30 15:33 |显示全部帖子
白膜层下的FICOLL呈红色,估计分离液有问题的可能性比较大,可以适当提高离心速度,或者铺平面的时候多分出来几管试试。
" r/ c* R8 T- I" j$ L( b/ t* |* H4 o我想知道你的CIK做法,在单个核分离前是否进行血浆分离?分离结束后是否进行贴壁分离DC与CIK?是把单个核细胞分离后直接按照CIK的方法养的?
+ A5 o5 n$ g0 _/ m我感觉你说的嘿嘿的东西是血小板,可以试试先进行血浆分离再做。
2 s$ X! g% R8 X我不是很确定 所以仅供参考
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发表于 2012-12-7 16:58 |显示全部帖子
回复 kiss2346 的帖子
" S8 [7 N' t8 q& Q! p: r# \7 g# ^+ ?  S/ j$ K6 p  b! J: `( m
最近一直挺忙的,首先,我的CIK是分离血浆的;第二,分离后进行贴壁分离DC\CIK;第三,我们提高离心速度后,分离液又变的透明了,查看了厂家FICOLL的说明书后,大致可以推测可能是气候原因,天气冷了,GMP车间内温度最近一直在20度以下。
% t6 B8 }0 @9 F& ]' H
& K* [! u2 S3 y( ? 再提高离心速度后,分血依然存在黑黑的东西,手机拍不了照,郁闷。不过现在离心后,少了很多。有人说是血小板,有人说是细胞碎片,有人说是粒细胞。. ~8 k/ V2 |1 K8 d0 j
- x; x6 G( K0 @9 P8 M: V6 D9 b
   镜下观察,在4×10下观察,与透亮的细胞相比,小很多,呈黑色颗粒,观察有悬浮的,不过绝大多数贴壁。  在40×10观察下,调节粗细螺旋,可以发现,这种物质呈绿豆样,在一定角度下,也反光,透亮。* U( \+ v4 v2 ~' R/ }; _
5 s- j! O9 h: p+ S0 d- l

3 g$ K3 v2 a$ c4 u0 f/ `) P元芳,你怎么看?
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发表于 2013-1-7 08:50 |显示全部帖子
回复 突击兵之小土豆 的帖子
; z7 [. R, z& g* y% g9 v
9 N: I8 `0 n3 B, Z  O( e你每次做培养之前不会用计数仪进行计数么? 最近每次做的时候在正常要进行贴壁培养的时候,再添加一步1200/10min的离心,能够较好的去掉血小板,如果不放心可以再加一步。看看效果,感觉一下是什么东西在里面。还有一种可能那些东西是红细胞,不过红细胞在培养一段时间之后一般会自行裂解,不过有红细胞 和血小板的细胞在初期看的时候培养液都会非常脏,一直有各种各样的碎片在里面。这个还是要你自己去判断了,天气变冷适当调节一点条件试试吧
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发表于 2013-1-7 08:51 |显示全部帖子
还有最好是在培养前进行一下计数  用仪器。。。。这样可以初步判断 血小板的量 红细胞的量  还有你分离结束后 分离出来的细胞沉淀是不是红的?还是白的?如果是红的 真的很有可能是红细胞在里面 。
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发表于 2013-2-26 11:18 |显示全部帖子
你在培养过程中是否加了血清,有没有可能是黑胶虫
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