MEF用丝裂霉素C处理第二天就崩盘

刘森泉

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用PBS能完全溶解吗？我的用水溶，还有小片状么。

huangcong1988

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" G* m/ l( I8 H& b/ c
/ v9 Z1 G1 \7 Q- z4 k0 J我养mef，传两代就污染了，细胞里面全部都是沙子样小黑点，怎么回事呢？分的时候还是很好啊

刘森泉

回复 huangcong1988 的帖子7 P( x% D" M- l. a- E: _
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污染得原因多种多样，不能确定，能做的就是把PBS，胰酶，培养基全部换掉，重新复苏细胞试试。

huangcong1988

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还有就是我分了MEF之后冻存，结果怎么复苏也复苏不起来怎么回事呢？程序冻存盒，冻存液也很好

刘森泉

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% @5 e' l' |: J# Z! S' b$ K3 G- m; U4 u5 S) X
用同样的方法冻存下293T这些较好养的细胞，证明冻存方法OK的情况下只能看你的细胞状态了。

wbj1983

1、MEF传代次数一般P3-5，不适合用代数太高的。% h6 O7 q7 X; I
2、丝裂霉素C最好用sigma-M0403-2mg的。* h/ z1 J) t8 `2 N- C6 |4 [
3、2mg丝裂霉素C先用PBS溶解均匀，一般避光混匀5-10min，再加到培养液中，工作浓度10ug/ml。
0 ^2 b  U/ B8 q2 j/ ^4、处理时间2-2.5小时不能超过3小时。注，处理2-2.5小时后用PBS洗2次，此步骤很重要！& G9 w+ U, K7 G* @
5、冻存时如果经费充裕的话可以用10%DMSO+90%FBS，效果能佳。
% E0 {0 K0 f+ S6 C! p这是自己做Feeder的经验，大家可以参考，如有问题可以继续交流。

wbj1983

回复 刘森泉 的帖子  s( e2 n% K$ {) w# I: T  k

6 d3 h( n8 [- @4 c) A1 Y1、MEF传代次数一般P3-5，不适合用代数太高的。
' B* Y0 H0 ~9 ]0 h! s! W( f2、丝裂霉素C最好用sigma-M0403-2mg的。% m+ Q# D- p7 W% r4 ]1 |) ?
3、2mg丝裂霉素C先用PBS溶解均匀，一般避光混匀5-10min，再加到培养液中，工作浓度10ug/ml。
& T1 W4 ~) t- ]7 D3 v4、处理时间2-2.5小时不能超过3小时。注，处理2-2.5小时后用PBS洗2次，此步骤很重要！
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这是自己做Feeder的经验，大家可以参考，如有问题可以继续交流。

wbj1983

上面的丝裂霉素C是：sigma-M0503-2mg的# n. o: ~0 `" V
打字的时候打错了，非常抱歉！

bibottll

我才做过的，细胞长得很好啊，5微克/微升，PBS溶解，处理三个小时后用PBS冲洗5-6次

开心果王

我一直用的是海正的，没有发现细胞全死掉了的现象，我们一般处理后就消化计数并冻存起来了，并没有继续培养，只是在复苏后会发现有死细胞漂浮，但贴壁的细胞还不错啊！我是用PBS配的，不知道楼主是否某个环节出现了失误还是什么其他的原因，可以将自己觉得疑惑的地方跟大家分享一下。