PCR克隆基因酶切的问题

daviddow

回复 linzi214 的帖子. d8 J6 k. X7 P1 v$ J4 p- A

3 R0 R2 _. \0 |2 g0 V3 ~$ O我也用的是50ul的反应体系，谢谢你的建议

c05241037

没有目的条带只有100bp的？这个大小应该是引物二聚体，没有出现弥散条带的话产物降解可能性非常小，降解通常会出现彗星感smear，你有没有跑PCR产物？建议跑胶PCR产物。

daviddow

回复 c05241037 的帖子1 x* o* v/ p' N
# G1 Q& [% r& d8 w
我跑了，是1200bp，很好。就是酶切以后，出现了问题。

c05241037

给你说说我以前的克隆吧，
0 Q7 O! g) v' pPCR 体系50ul、30循环，* ]" D* }+ L, G3 a1 s! D
PCR跑胶3ul其余全部纯化（MP或者Omiga的试剂盒，主要是去掉PCR体系中的酶buffer等），纯化得15-20ul，
& A: a4 b1 C# p5 j" _- `双酶切50ul体系（纯化的PCR产物全部酶切，HIND3、BamH1用1.5ul），37度60min，跑胶纯化得8-10ul
$ [8 n( g  I9 F. ]% f5 @一般PCR产物都是要纯化后酶切，目前还没有沉淀就酶切的经验" s1 q" V" I$ F
我以前碰到的酶切降解情况是因为试剂中有污染，比如buffer、水、或者其他？酶切中的试剂污染到DNAse，建议换试剂或者做验证试验看看污染源。

c05241037

给你说说我以前的克隆吧，& v/ W0 S' J# D# I
PCR 体系50ul、30循环，
3 d, ^8 [0 F/ j# aPCR跑胶3ul其余全部纯化（MP或者Omiga的试剂盒，主要是去掉PCR体系中的酶buffer等），纯化得15-20ul，1 C/ p- d' e* U* z; W5 w
双酶切50ul体系（纯化的PCR产物全部酶切，HIND3、BamH1用1.5ul），37度60min，跑胶纯化得8-10ul# |9 I, N$ m1 k( [5 i3 f( e
一般PCR产物都是要纯化后酶切，目前还没有沉淀就酶切的经验
- [' \) y& u" O2 D: A& R我以前碰到的酶切降解情况是因为试剂中有污染，比如buffer、水、或者其他？酶切中的试剂污染到DNAse，建议换试剂或者做验证试验看看污染源。

daviddow

回复 c05241037 的帖子. v. \. A0 ?- \  X- m- q
4 _6 z. B8 e& H: w4 o& \
谢谢c05241037 ，不知道你用的内切酶是哪个公司的？