成脂诱导液的详细配置过程和连续添加诱导的具体细节，供参考~

相宜

关于脂肪来源干细胞的成脂诱导问题：我养的脂肪干细胞已经传到第五代，细胞生长活力良好，形态也较好。现在我买回了IBMX、牛胰岛素、地塞米松和吲哚美辛四种试剂。但是买回来的都是粉剂，按照说明有的4度保存有的-20保存，关于成脂诱导剂的配比问题本论坛也有相关的论述，但是想请教各位大侠我的细胞现在还在培养瓶中培养，按照文献和论坛的说明，是要在将其分装到96孔板中吗？四种试剂都怎么配制呢？具体需要用那种液体去溶呢？溶过之后怎么保存呢？诱导的时候是将溶好的试剂直接加入96孔板还是直接滴进培养瓶呢？后期的油红O染色是怎么进行的呢？请各位大侠不吝赐教。

ditiger

我来回答：1.成脂成骨诱导48孔或24孔较好，既不浪费，又能保证拍到好的细胞。
4 j; T" q/ i# y

ditiger

6 y( j' S, {1 W" A6 ~4 ?% k; c( Z6 _6 ^6 z) I2 w
我来回答：2和3和4：地塞米松（DEX）， 称取4mg地塞米松，溶于10mL 无水乙醇中，0.2μm无菌滤膜过滤后，分装到EP管中，配成10-3mol/L（1000X）储存液，-20℃冰箱保存。/ v3 [# P4 G$ b4 s4 r! R# Y  S7 W
IBMX，100mg，溶于9mL 二甲基亚砜（DMSO）中，0.2μm无菌滤膜过滤后，配成50mmol/L的储存液（100X），-20℃冰箱保存。
+ c* t% ~1 O; u9 ?5 bIDM（吲哚美辛）， 称取89.45mg 溶于5mL 无水乙醇中，0.2μm无菌滤膜过滤后，配成50mmol/L的储存液（500X），-20℃冰箱保存。
+ ^3 F4 p% Q) k" n- {' K胰岛素我用的是人的，将胰岛素配成10-4（1000X）的储存液。

ditiger

问题5：将ADMSCs按照4W/孔加入24孔板，一般做一排（4个复孔，一个对照）第二天换成诱导培养基，每孔500uL.每隔2天换液一次，8-10天即可结束。会有十分漂亮的向一串葡萄似的脂肪细胞！

ditiger

问题6：染色的主要过程为：小心弃掉上清，生理盐水小心清洗三遍，4%多聚甲醛室温固定30分钟，再用生理盐水清洗3遍，加入油红O染色工作液，1小时后弃掉染色液，生理盐水清洗3遍，倒置显微镜下拍照。

liluli0715

补充一点：0.5%油红O临用前用蒸馏水3:2稀释，再用0.22um滤膜过滤

stemcellmeng

一般来说诱导过程都是在24孔板中进行的，这样效果比较好，要做油红染色的话，这里有一个从网上找的步骤，可以参考一下，我做出来效果不错。
6 S6 t9 |+ X4 Z% k; m& E- D4 i- Z1 先小心轻缓倒去培养夜。
4 d7 K5 l( U9 V8 Q. a2 用pbs轻缓漂洗（不洗没问题）。- y4 w) ]. U) M+ g) o# y. t. C
3 加10%中性甲醛固定30min（4%的固定液也可以）。固定的是细胞膜。
& B* z% Z, R$ S1 u% Z4 稀释油红储存液，油红：去离子水＝3:2，滤纸过滤（或者0.4um滤器），室温放置10min（除去一些杂质，染色结果更清晰）。 1 Z8 b( z: S, ]7 Z
5 染色10min左右，加的体积覆盖住板底即可，如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml（实际染色时间1小时都可以）。
( J) H1 I! Y; z+ R7 F$ X) x# C( a) V6 脱色，用75%酒精/60%异丙醇漂洗，除去多余的染料（实际用其他平衡液洗也没问题，背景并不会残留多少）。
! t! E) \4 G$ A7 s7 复染，淡苏木染色1/5分钟，pbs漂洗（这一步不做也可，看试验需要，并且苏木素会把胞浆染红，如要显示核， hoechst33342也可以，浓度5微克/毫升染10分钟即可把核染上）。
# m0 a" y6 r. c8 n8甘油明胶封片（封片后可长期保存）。 " m* w9 U- ]; I
9 显微镜观察。 2 Y6 P; l  H) Y! ~- u1 R

amberma

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+ l6 X" y: o$ Y+ u' k2 J
6 N5 w: {. k: O" ^$ a( r* i请问IBMX用DMSO溶后，是用普通的0.2μm滤膜吗？DMSO会把膜溶解吗

ditiger

回复 amberma 的帖子& b5 d8 }8 b0 C" n" D' o* z

" s  t  Y+ h1 S: P* n# ?2 N: E膜分为过滤有机溶的，和过滤水溶的，选择有机溶的。
, z7 C. M" D% o' s8 S  v( u6 Q另外实际上，不用膜过滤也可以，因为DMSO根本不长菌，呵呵

相宜

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# p- g. c+ H$ ]; R
' v8 l0 F# O) i4 i& x大侠你好，10-3mol/L，，配成50mmol/L的储存液（100X），这些毫摩尔每升是怎么换算的？高中的化学没学好都忘完了，求详解。