第一次培养NSC，遇到的问题和分析，求大神指教

jessewill

我第一次也是我们实验室第一次分离NSC，我采用的方法是悬浮培养，用E14.5天的B6小鼠胚胎，分离脑膜 血管，剪碎大脑，然后用Trypsin/EDTA消化2分钟，再吹打30次左右，离心过滤，在DMEMF12+N2+B27+bFGF+EGF的培养基中培养。密度是5*10E5培养，分两皿分别用corning平板和国产细菌平板培养。
4 k0 E: D/ b  k2 h: a3 D12h，形成较多的Neurosphere，状态良好。! y0 Q4 W9 {  x; k' n1 \2 u
48h，发现neurosphere出现很多贴壁的现象，球周围还有足状的细胞伸出9 K6 n+ l( c, b7 @
72h，很多很多neurosphere贴壁。一皿只有10个左右的神经球。。。) O# O7 v( p6 R

( c2 i8 v: w. i+ ?9 W+ h* n大量细胞贴壁分化的原因，个人猜想
0 @" X  }2 N/ W3 d1.取E12.5的胚胎大脑5 H2 m; k/ S6 N' {7 i! X. Z
2.死细胞过多，可能trypsin对细胞损伤较大？死细胞过多影响了PH？8 G0 [+ m3 T3 V$ ?* k- a% ^" |
3.24hrs，加一些新鲜培养基？8 _8 r% i- F* i5 t. j6 Q  B" F

; J2 B9 `& a, I高手指点指点为什么我细胞贴壁分化的那么多

sanfa

因子量不够吧

学无止境

N2和B27放一种就行了，不要两个都放。

changbo529

我在DMEMF12+B27+bFGF+EGF的培养基中培养，感觉还不错

xiaoqi

用B27就行了，下次试试不用Trypsin/EDTA消化。

rhmm

bFGF的量够不够，这个对于NSCs悬浮很重要呢，还有你消化了之后血清洗干净了没有，最后建议你可以试试Gibico的Neurobasal培养基试试只需加血清和生长因子就可以了！个人之见--互相学习！

Tim

Trypsin/EDTA消化的浓度是多少？？我一般都是用机械法！用1ML的枪头吹几次就好啦！！

only2413945

首先，从你的步骤看来，你没有10%FBS终止消化的步骤，最好是终止消化过后离心培养液悬浮，另外你的消化时间2min，有点短，致使你的细胞团比较多，而单个细胞较少，一般10min比较好。个人经验，不知道对你有没有帮助，献丑了！

dxldeyou_2006

我用的培养基没加N2，贴壁可能是因子量少了点哦

yinjiqingqq

细胞密度是否太小了？