请帮忙分析下RNA电泳结果

huangcong1988

RNA跑胶最好还是用变性胶，但是如果不用变性胶的话，胶中加点氢氧化钠也会使得图片好看点，胶的浓度对于跑胶结果，个人觉得没太大影响，胶浓点就少跑会，稀点就跑时间长点，跑胶这么短的时间不会说就使得RNA降解的，RNA降解主要还是在提取过程

jiojoo

回复 cneagle66 的帖子
8 ~# _. c7 |& s* v5 _1 P9 Y+ }& X) C
8 h) m, h# u, l) S, @$ N2 b我在做RT-PCR之前都会用DNaseI消化DNA的，这样DNA应该可以去除干净了吧？
9 m! x2 v# {' [; I另外，我的目的是检测mRNA的表达水平，用Radom引物有没有问题？因为照原理来说，Oligo dT引物应该更好。5 h( u8 C0 l! d$ ?5 t
上面那块胶中的样品，我做PCR得出的结果还是非常稳定的降解严重和不严重的结果都差不多。

jiojoo

回复 huangcong1988 的帖子# U7 }: q4 m4 L% `* b# N6 N

# {% M* E+ z5 e: f9 T感谢回复# W5 N( p( y5 _% y  x! @+ k
我用的是Omega的RNA提取试剂，类似Trizol的试剂。这些是分次裂解于裂解液中，冻于-20度几天后再一次性提取的。
; h8 `  l5 @! Y% A5 A5 C还有些问题请教
9 ], P4 F& T5 F. Q6 l* D1 M基因组的话，为什么是很单一的一条带呢？不是应该是一条弥散的带吗？) Q- k3 F0 Y+ m$ P' D
Fermentas的DNaseI消化DNA后样品的DNA污染应该可以消除了吧？) h0 z, h; n/ l  t" R! x
反转录后还需要用RNaseH去除RNA吗？

jiojoo

回复 星移龙一 的帖子
- F" _3 t0 l8 b: v* [2 c0 k
( P5 O  p. }5 M$ [凝胶的问题会不会出现这种情况？
: I7 `( G# ]+ M# F3 A我们这里是刚开始做生物方面的实验，之前我一个同学配胶时用的水而不是TAE
0 T. I7 t7 Q; H% o) V$ R. h结果就是一条弥散的带，像降解了一样3 [1 [& r1 T6 H8 X/ i
然后他又用TAE来配，又跑了一次，结果RNA完整性其实是很好的

jiojoo

回复 huangcong1988 的帖子
8 {# R7 T( t7 b/ I) T5 u, _$ t! I
( h8 }4 k5 t! r9 D+ k1 o0 \& Y感谢回复5 x6 ~& Z2 N1 t! C- u* s& a
NaOH怎么加？需要加多少？NaOH的效果是不是也是使RNA变性？还请指教
; U: |: P  `( e  ]另外，胶浓的话应该是多跑一会儿吧？

xfyangsibs

降解严重，DNA污染同样严重。降解，，，，防降解的法子都用上，DNA除一下就行了

星移龙一

回复 jiojoo 的帖子
' [) s2 y1 d9 I) A
0 ]: B2 N8 {7 r- N/ a会啊，如果你用的水不太好，很容易在电泳过程中导致RNA的降解。

zhaoyan1983

我感觉如果只是实时定量PCR的话 应该是可以用的，但最好有内参 另外点样太多 有可能在你最后一个孔点样之前 前边几个就有部分降解了也说不定 RNA太小 最开始点样之后最好大电压跑一下 让RNA全部进到胶里边 所以感觉不一定是你提的不好 可能是跑的过程中降解了

cneagle66

jiojoo 发表于 2011-12-5 17:14
% v9 X+ l& M& w) d* f, j回复 cneagle66 的帖子
* e, a" Z. m* g* `, e" b
. d9 d. `; K* p/ \我在做RT-PCR之前都会用DNaseI消化DNA的，这样DNA应该可以去除干净了吧？

; C* M1 D3 e/ f4 p/ G9 O
DNase消化是很常用的办法，应该是很好的去除DNA污染的办法，严格的实验都要求将DNA去除。
7 b# n4 [8 j9 i# M对于哺乳动物RT反应，用Oligo dT或者随机引物都可以。我前面说的引物设计问题，是指在PCR那一步，普通的RT-PCR可以通过设计横跨两个以上的外显子，来避免DNA污染所造成的扩增，因为DNA扩增出来的片段很大，或者因为内含子很长，从DNA扩增效率很低或不能扩增。但是对于荧光定量的RT-PCR，我不知道是不是也可以这样。至少我用sybr green的时候我是这样设计的，因为它不用探针，而且PCR产物较长，在一个大的范围内比较好挑选PCR引物对。但是对于用荧光探针的定量PCR，我没有经验。

huangcong1988

回复 jiojoo 的帖子. H: T$ r) A! j+ y" w# f' J

; M7 w, ^% D% n6 H# `7 n冻在负20数天？个人觉得可能冻在负80更好