MSC 冻存问题

dwl1209

回复 hwlightning 的帖子& j$ U' n4 o4 _: G% ?

4 b9 u) H& d: T7 A2 A1 ?请教，程序降温盒的原理是什么？为什么可以直接放-80℃呢？你的复苏效率有80%以上吗？非常感谢！

deshenglll

冻存液要加培养液的。还有就是你的细胞冻存密度也要注意。复苏后细胞的活率在70%比较低了。复苏培养后这70%里面估计还要损失个10%左右。

deshenglll

复苏时间要少于2min。

飞翔的十字架

回复 dwl1209 的帖子$ I' F+ i- X1 W( f+ e; s7 v5 E
. F2 V% z$ f% Y4 A8 @2 k5 U
程序降温盒中加入异丙醇，在-80℃冰箱中达到-1℃/min 的降温效果，即慢冻的效果。

tkpss18

之前有前辈跟我说过，细胞冻存血清的浓度不能太高，会对细胞往后的形态有影响。他建议血清冻存的浓度为20%或以下。我们现在冻存细胞的配方是10%DMSO+15%血清+65%DMEM。; \$ l# b! ]" {0 D
冻存的话还是建议用程序降温盒，效果会比较好。: {5 b- f$ [; D6 R' O1 S
复苏的话也想跟大家请教一下，我看过有人说不离心，直接加完培进去培养。第二天半换液去掉DMSO. 复苏的时候用离心还是不离心好？还有清洗DMSO用点滴法会不会好一点？谢谢。

yuwenlan

冻存液FBSMSO=9:1完全没问题。最大可能是操作有问题。
9 n8 O- |- J: K, W; u娥的操作：1.冻存液，新鲜配制后0.22um过滤后4度储，不超过1周使用。2.冻存细胞时候冻存液（4度）重悬细胞后分装到冻存管，放进冻存盒（4度），直接放进-80度冰箱，过夜，转液氮。3.复苏细胞要尽快将细胞从气态液氮或-80度环境置于37度水浴摇晃，待还仅剩一小小块冰晶时候取出。4.细胞可直接接种，或者去除一下下DMSO（10倍体积预热培养基稀释后离心）再接种。
: F$ |* L( y# M2 K% X: X8 O注意：从水浴里取出的细胞用培养基稀释步骤要缓和，细胞有个适应DMSO浓度变化的过程。
/ B4 R7 m" i9 |% f4 y; W, p$ VGood luck.

tkpss18

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我想请问一下大家在复苏的时候，如果是用离心的方法去DMSO的话，在离心完后有没有出现像Jelly like substance的东西，这个有人说是因为复苏的时候DNA会从死掉的细胞释放出来，然后会把附近的细胞团在一块。其实这个情况也不是每一次也会发生，但是一旦发生了就会有很多细胞流失。是不是唯一的解决方法就是加DNAse?

tkpss18

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; R: H' B9 I1 U. A; V我想复苏的时间主要是根据样本复苏的体积和容器来确定。最主要是不要把样本完全解冻。

湖南干细胞

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: j1 s* \! ?9 z& T7 t2 k0 r( D* M$ O0 {
细胞复苏时，我们都是37℃水浴，42℃会不会太高了

hwlightning

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9 u$ g7 q3 S" c/ ~( N+ q/ o7 u
$ O1 _' Q/ V' z8 a. o我复苏细胞一直用的是42℃，复苏的细胞情况都非常好。
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