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不同的细胞已及转不同面积的孔板操作起来略有不同,以转染六孔板的贴壁细胞为例:( S3 L# R# X+ _3 k5 c
1.接种细胞。转染前一天将细胞接种至六孔板内。细胞接种数量视其生长速度而定,一般为1×106个细胞。转染时要求细胞汇合度为90~95%。转染前两小时对细胞进行换液。7 B# ] P) E4 F. E \
2.将4ug的质粒DNA加至250ul的OPTI-MEM培基中,混匀。. J. s9 d, r6 X) ?( W8 E
3.将10ul的Lipo2000加至另外250ul 的OPTI-MEM中,轻轻混匀,室温静置5分钟。& c4 Y1 o5 F, A$ {( c
4.将DNA悬液和Lipo2000悬液混合,总体积500ul,轻轻混匀,室温静置20分钟。
$ m, h5 `; A+ c! h8 p( L5.将DNA和Lipo2000混合液加至六孔板的孔内,前后左右晃动孔板混匀,置于培养箱中培养。6 N# s0 R- x* p( k
6.转染4-6小时后,细胞换液,每孔2ml培基。
7 O( i/ t9 M3 T1 M) O4 ~7.转染18-48细胞后,收集细胞检测表达,或加入抗性培基筛选稳定表达克隆。2 Q* P; e. U! a, P. H* @( O+ U
* Q1 W& d4 L0 k% T- n" w
注:1. 如果没有OPTI-MEM培基,用培养细胞的无血清基础培基替代也可以。& g) q1 i" Q6 A$ e
2. 该说明为一个孔的用量,同时转几个孔时按需加倍。若转染其他类型孔板,DNA和Lipo2000用量参见试剂盒说明书中的表格。可根据实际质粒和细胞的转染效率,分不同量摸索最佳DNA和Lipo2000的混合比例。( g: v( ]; G: s2 t1 p( w! K/ Y, [
3.转染4-6小时后也可以不换液,但由于Lipo2000具有一定的细胞毒性,作用时间过长可能使某些细胞出现大量死亡现象,建议换液。1 u" D( w9 c3 ~( F
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