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作者：王志东 冯四洲 周世勇 王玫 周征 翟文静 韩明哲作者单位：中国医学科学院、中国协和医科大学血液病医院、血液学研究所，天津 300020 , J4 J0 C9 h# i5 j) V$ _. h
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【摘要】 本研究探讨移植物FOXP3 mRNA表达与HLA相合同胞供者异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的关系。对26例HLA相合同胞供者异基因造血干细胞移植患者移植物CD4 CD25 和 CD4 CD25high T 细胞、FOXP3 mRNA表达与aGVHD的关系进行了评价。用流式细胞术检测了脐血、正常人外周血、移植物的CD4 CD25 和 CD4 CD25highT 细胞比例；以β2-MG为内参照，实时定量RT-PCR检测了FOXP3 mRNA相对表达量，采用融解曲线和琼脂糖电泳鉴定PCR产物特异性。结果表明： 正常人外周血、动员的外周血干细胞（PBSC）和BM移植物CD4 CD25 T细胞为连续的细胞群，CD4 CD25 T 和 CD4 CD25highT 细胞比例分别为（48.5±16.3）%和（9.6±2.5）%，（42.1±14.7）%和（13.1±4.2）%，（43.4±9.6）%和（14.6±4.5）%。aGVHD组移植物CD4 CD25highT细胞比例和绝对值与无aGVHD组相比无显著差异（P>0.05）。不同稀释倍数的FOXP3和β2-MG实时定量PCR相对扩增效率曲线斜率为0.0826；融解曲线分析表明均仅有单一峰，Tm值分别为86.5℃和 82.3℃；琼脂糖电泳显示都仅有单一扩增产物。PBSC移植中无aGVHD组FOXP3 mRNA相对表达量（中位数41.0×10-5）是有aGVHD组（中位数12.9×10-5）的318%，二者有显著性差异（P=0.03）。COX回归法分析排除aGVHD其他相关因素的影响。结论： CD25不是CD4 调控性T细胞可靠的细胞标志；应用SYBR Green I 实时定量RT-PCR方法可特异定量FOXP3 mRNA；aGVHD组移植物FOXP3 mRNA显著低于aGVHD未发生组。FOXP3是调控性T细胞可靠标志，可能是预测aGVHD的有用指标之一。
0 D- T: Y5 M* [7 I. w4 Y6 ]0 |+ t 【关键词】FOXP3；基因表达；急性移植物抗宿主病；异基因造血干细胞移植5 W. o' r$ W& G8 l. T
Difference Between FOXP3 Gene Expressions in Donor Grafts with or without Acute Graft-versus-Host Disease) z _) L9 Z0 h0 r; N5 ]
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% Y) s6 o% ~9 \" ?2 E+ K0 F WANG Zhi-Dong, FENG Si-Zhou, ZHOU Shi-Yong, WANG Mei, ZHOU Zheng, ZHAI Wen-Jing, HAN Ming-Zhe* B3 t( e( I& E! Y4 F3 P
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Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Tianjin300020, China
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AbstractThe study was aimedto investigate the association of FOXP3 gene expression in donor grafts with acute graft-versus-host disease after HLA-identical sibling allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Twenty-six donor grafts (peripheral blood or bone marrow) and their respective clinical characteristics were evaluated. Flow cytometry analysis was performed to assess the percentage of CD4 CD25 and CD4 CD25highT cells in cord blood, healthy controls' peripheral blood and donor grafts. Relative transcripts ofFOXP3 mRNA were determined by real-time quantitative reverse transcription -polymerase chain reaction with β2-MG as the internal control gene. The specificity of FOXP3 and β2-MG amplifications was confirmed by analyzing the dissociation curves and electrophoresis of the target amplicon. The results showed that the CD4 CD25 T cells in peripheral blood, peripheral blood stem cell (PBSC) or BM grafts exhibited a continuous and primarily low expression of CD25 and the frequencies of CD4 CD25 T and CD4 CD25highT in CD4 T cells were (48.5±16.3)% and (9.6±2.5)%，(42.1±14.7)% and (13.1±4.2)%，(43.4±9.6)% and (14.6±4.5)%,respectively. There was no significant difference in the frequencies and absolute numbers of CD4 CD25highT cells between patients with aGVHD and patients without aGVHD (P>0.05). The plot of log transfused cDNA amount versus ΔCt had a slope of 0.0826 which indicated approximately equal efficiency of FOXP3 and β2-MG amplifications in real-time PCR. The specificities of amplification were confirmed by analyzing the dissociation curves and electrophoresis of PCR products with the values of Tm 86.5℃ and 82.3℃, respectively. The relative transcripts of FOXP3 in PBSC grafts of recipients without aGVHD were 318%high as those with aGVHD(median of 41.0 10-5 and 12.910-5, respectively) (P=0.03). No significant difference was found in other related variables for GVHD. It is concludedthat coexpression of CD4 and CD25 maybe insufficient to identify regulatory T cells; FOXP3 mRNA expression may be specifically quantified with real-time quantitative RT-PCR using SYBR Green I chemistry. FOXP3 mRNA expression in donor grafts is significantly low in patients with aGVHD compared with patients without aGVHD. It indicated that the expression level of FOXP3 mRNA may be one of the useful indicators forin predicting aGVHD.
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, d6 n9 \( G3 _1 o" ^/ v( c; b$ n) G- { Key wordsFOXP3; gene expression; acute graft-versus-host disease; allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
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异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治疗恶性血液病和遗传性疾病的有效手段。急性、慢性移植物抗宿主病（GVHD）仍然是allo-HSCT主要并发症和死因之一。传统的GVHD防治方法常有许多副作用，寻找更特异有效GVHD的防治方法成为目前allo-HSCT研究热点之一。调控性CD4 T细胞（CD4 CD25 Treg）是一群组成性表达IL-2受体α链(CD25)的CD4 T细胞［1］，天然或经体外扩增的CD4 CD25 Treg可预防或减轻小鼠急性GVHD（aGVHD）［2］。迄今未发现CD4 CD25 Treg特有的表面标志。研究证实，Foxp3（人为FOXP3）及其编码蛋白特异表达于调控性T细胞［3］。我们检测了HLA相合同胞供者移植物CD4 CD25 T 、CD4 CD25highT细胞的比例，应用实时定量PCR检测移植物FOXP3 mRNA的表达；并分析其与aGVHD的关系。
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材料和方法
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' c3 r4 n* {$ i# d 病例和标本
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2004年6月至2005年6月在我院行HLA相合同胞供者异基因造血干细胞移植患者26 例，中位年龄41（16-51） 岁，男15 例，女11例，其中外周血干细胞移植（PBSCT）16例和骨髓移植（BMT）10例。26例患者中急性白血病11 例，慢性髓细胞白血病（慢性期）9例，加速期和急变期共3 例，重型再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤各 1例。采用含TBI预处理方案 7例，BU/CY为主方案19 例。GVHD预防方案：CsA MTX 20例，FK506 MTX 6例。供者中位年龄 40（18-54）岁，女性供者男性受者 5例。标本取自行HLA相合健康同胞供者异基因造血干细胞移植的外周血或骨髓移植物，所有供者均经G-CSF动员；12例正常对照周血取自正常自愿者；5例脐血取自正常足月顺产胎儿。aGVHD诊断和分级标准参照西雅图标准［4］。
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! ?; [9 b7 X7 c/ \' w 流式细胞术检测脐血、正常人外周血和移植物的CD4 CD25 T比例
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取约含1106细胞的标本加入FITC-CD4、PE-CD25单克隆抗体（PharMingen公司产品）各10 μl， 混匀，4℃避光孵育30分钟；加入溶血素，室温避光孵育10分钟，PBS洗涤2次， 流式细胞仪（Becton Dickinson公司产品）分析，结果用CellQuest软件处理。CD4 CD25 T细胞中CD25荧光强度超过CD4-CD25 T细胞群CD25荧光强度部分为CD4 CD25highT细胞［5］。& v2 e; ] s$ ~: }
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移植物单个核细胞总RNA的提取
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6 ]4 a* w$ O' m% J: h 细胞总RNA用TRIzoL试剂（Invitrogen公司产品）提取。操作按照试剂说明书进行。所抽提总RNA经紫外分光光度计260和280 nm处的吸光度（A）值测定纯度和浓度，A260/ A280值在1.8-2.0者用于RT-PCR。* e: L1 t, x5 {, d" v7 C5 a
! z8 d" a% Q& y/ S d: t" A 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
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" _7 p. M6 M3 o6 Q: e% C cDNA的合成取总RNA 1 μg用于cDNA的合成，逆转录酶购自Invitrogen公司。逆转录反应的体系：5first strand buffer 8 μl， DTT(0.1 mol/L) 4 μl，dNTPmix(10 mmol/L each) 2 μl，随机引物(500 ng/μl) 2μl，RNasin(40 U/uμl) 1 μl，逆转录酶 400 U，总RNA1 μg，加水补至40 μl。反应条件：37℃，60分钟；70℃，10分钟。0 L1 u# l$ \6 i" ?! u
* w1 M# E" |$ V, H( i1 I1 @ n) m实时定量PCRFOXP3引物序列:上游5′-CAA GTTCCACAACATGCGACC-3′ ；下游5′-GGTGGC AGGATGGTTTCTGAA-3′ ,扩增片段144 bp。同时以β2-MG为内参照，引物序列:上游5′-ACCCCC ACTGAAAAAGATGA-3′ ；下游5，-CATCTTCAAA CCTCCATGATG-3′ ,扩增片段124 bp。25 μlPCR扩增体系含SYBR○RPremix Ex TaqTM 12.5 μl（大连宝生物公司产品），cDNA 1.5 μl，上、下游引物各 10 pmol/L，ROX Ⅱ Reference Dye(50) 0.5 μl，去离子水补至25 μl。实时PCR反应条件：95℃预变性 10秒；95℃5秒，60℃ 40秒，40个循环；融解曲线分析，95℃15秒，60℃20秒，重新缓慢解链至95℃ 15秒。反应在7500型定量PCR扩增仪（美国ABI 公司产品）进行。取10 μl PCR产物，1.5%的琼脂糖电泳观察PCR产物。以β2-MG为内参照，测定FOXP3和β2-MG相对扩增效率：将1 μg的总RNA逆转录后的cDNA（25 ng/μl）分别稀释成1、0.5、0.2、0.1 ng/μl，分别取1.5μl进行实时PCR，得到不同稀释倍数样本的FOXP3和β2-MG的Ct值，以cDNA量对数值得为横坐标，ΔCt（ΔCt =Ct FOXP3- Ctβ2-MG）为纵坐标，做图求斜率。如斜率
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b1 E9 R4 ?* ?4 ~ 统计学分析
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采用SPSS 10.0软件分析， 进行Mann-Whitey U检验、确切概率法检验。Cox回归法多因素分析GVHD的相关危险因素。P
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结果
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移植物中细胞成分 T" O) o! d4 L0 a: j# S
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移植物中总有核细胞（TNC）中位数为 5.31(1.31-9.61) 108/kg，CD34 细胞中位数为 2.56(1.03-7.56) 106/kg ，CD3 细胞中位数为3.49(0.33-16.96)107/kg。
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' O9 p8 l: j1 b1 Y: o% V% H) o J, g; z+ W aGVHD1 r. v( t6 d7 v% @
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所有移植患者均造血重建，移植后100天内，2例慢性髓细胞白血病（加速期）复发，1例慢性髓细胞白血病（急变期）死于VOD，均无急性GVHD。PBSCT者中，37.5% (6/16)发生aGVHD（Ⅰ度5例， Ⅱ度1例），中位时间移植后35天；BMT者 中，10%(1/10)发生Ⅰ度aGVHD（移植后69天）。
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脐血、正常人外周血、PBSC和BM移植物CD4 CD25 T和CD4 CD25highT细胞比例
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: U4 J; L V$ N9 X+ D4 J, F 脐血CD4 CD25 T细胞为一明显独立细胞群，而正常人外周血、PBSC和BM移植物CD4 CD25 T细胞为连续的细胞群。脐血CD4 CD25 T细胞占CD4 T细胞(12.4±4.7)% (9.0%-20.7%)；12例正常人外周血的CD4 CD25 T和CD4 CD25highT细胞的比例，分别为(48.5±16.3)% (22.3%-78.8%)和(9.6±2.5)%(5.5%-12.8%)；PB移植物CD4 CD25 T和CD4 CD25highT细胞的比例，分别为(42.1±14.7)%(7.7%-58.9%)和(13.1±4.2)%(7.2%-18.8%)，CD4 CD25highT的比例高于正常对照（P=0.023），而CD4 CD25 T细胞比例无显著性差异（P=0.321）；BM移植物CD4 CD25 T和CD4 CD25highT细胞的比例，分别为(43.4±9.6)%(29.7%-58.2%)和(14.6±4.5)%(10.2%-23.1%),与PB移植物比较均无差异（P值分别为0.824和0.441）（表1）。Table 1. CD4 CD25 T and CD4 CD25highT cells in CD4 T cells（略）
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& s0 _; V2 }. G0 P$ n 移植物CD4 CD25highT 细胞的比例、绝对值与aGVHD的关系, E) n1 `& ]% V3 w% d/ m8 V, B
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PBSCT中，aGVHD组CD4 CD25highT 细胞比例的中位数13.3%，与无aGVHD组的13.25% 相比无显著性差异（P=1.00）；BMT中， aGVHD组CD4 CD25highT细胞比例为 23.1%，高于无aGVHD组的11.7%, 但无显著性差异（P=0.13）。PBSCT 中，aGVHD组CD4 CD25highT细胞的绝对值中位数 11.5104/kg ［(2.77-18.19)104/kg）］与无aGVHD组中位数4.81104/kg［(1.81-22.1)104/kg］相比，无显著性差异(P=0.144)；BMT中，aGVHD组CD4 CD25highT细胞的绝对值 4.95104/kg 与无aGVHD组2.49104/kg［(0.72-2.72)104/kg］相比也无显著性差异 (P=0.143)。
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' q9 r- {1 K# a# r, F, B, U FOXP3 mRNA定量PCR的相对扩增效率曲线和扩增特异性% ]3 M; h% D5 v' _
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不同稀释倍数实时PCR的结果见表2。拟合直线斜率0.0826,小于0.1，说明可采用相对定量方法定量FOXP3 mRNA的表达。融解曲线和PCR产物电泳证实PCR扩增的特异性。融解曲线和扩增曲线见图1。由图1可以看出，FOXP3和β2-MG均只有一尖峰，解链温度（Tm）值分别为86.5℃和 82.3℃，说明分别仅有一扩增产物，PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分别仅见一条带，进一步证实了扩增的特异性（图2）。Table 2. Average Ct value for FOXP3 and β2-MG at different transfused amounts（略）
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移植物FOXP3 mRNA表达与CD4 CD25highT/总细胞数比例的相关性( P' U1 C H" _. o8 o' s4 T0 V
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FOXP3特异表达于调控性T细胞，为分析CD4 CD25highT是否为调控性T细胞，我们对移植物FOXP3 mRNA表达与CD4 CD25highT/总细胞数比例做相关分析，发现无论是PBSC还是BM，二者都没有相关性（P值分别为0.853和0.337）,说明CD25high不是移植物CD4 T调控性T细胞特异标志。, o+ `5 T! O/ u$ `) t1 L
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}( v, u( R5 B# N 移植物FOXP3 mRNA的表达与GVHD关系/ N. |3 C6 ^; d9 H v8 j/ x
9 z0 B3 i( y, s0 j/ E+ A' J/ a PBSCT中,无aGVHD组FOXP3 mRNA相对表达量（中位数41.010-5）是aGVHD组（中位数12.910-5）的317.8%，二者有显著性差异（P=0.03）。BMT中，无aGVHD组FOXP3 mRNA相对表达量（中位数17.710-5）是aGVHD组（中位数2.510-5）的708%（P=0.22）。 M6 J# J1 J6 x# z# N% Q
& E' u. h( w( B& s6 w aGVHD其他相关因素分析) D! @+ p# `# d) h! l7 F
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进一步分析PBSCT和BMT中aGVHD相关变量对aGVHD的可能影响，COX回归发现TNC、CD34 、CD3 、供受者年龄、女性供者男性受者、预处理方案、GVHD预防方案等因素对aGVHD的影响均无显著性差异（P>0.05）。
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6 R( e. _9 n) \/ B p$ C 讨论
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( I% x& `: T2 G# m# [/ R 我们首先检测了脐血、正常人外周血和移植物的CD4 CD25 T细胞，发现脐血的CD4 CD25 T细胞是一独立的细胞群，而正常人外周血和移植物的CD4 CD25 T是和CD4 CD25- T细胞连续的细胞群；脐血CD4 CD25 T细胞比例（ 占CD4 T，下同）［(12.4±4.7)%］略高于正常人外周血CD4 CD25highT［(9.6±2.5)%］。经G-CSF动员和采集的移植物CD4 CD25highT细胞比例高于正常对照，分别为(13.5±4.3)%和(9.6±2.5)%，而与CD4 CD25 T细胞比例相比无显著性差异（P=0.321），这说明动员剂和（或）采集过程可能对CD4 CD25highT细胞有影响，机制不详。正常人骨髓含有一定数量的CD4 CD25 T细胞，通过CXCR4/CXCL12信号途径黏附于骨髓基质细胞，在G-CSF作用下，骨髓基质细胞CXCL12表达减少，骨髓CD4 CD25 T细胞被动员到外周血［6］，外周血CD4 CD25 T细胞比例可能增高。在正常人外周血和移植物中CD4 CD25 T占CD4 T细胞比例均在40%左右，明显超过5%-10%，它们不可能全部是调控性CD4 T细胞，而可能包含活化的CD4 T细胞。Baecher-Allan等［7］发现，正常人CD4 CD25 T细胞中仅CD4 CD25high部分有抑制CD4 CD25- T细胞增殖的功能。比较移植后发生aGVHD组和无aGVHD组的移植物CD4 CD25highT细胞比例和绝对值均无显著性差异，这表明CD4 CD25highT细胞不能有效抑制效应T细胞的增殖和分泌细胞因子，其原因可能是调控性CD4 T细胞比例太低或者CD4 CD25highT并非调控性T细胞。Stanzani等［8］的研究结果认为，供者CD4 CD25highT细胞是GVHD的危险因素，供者CD4 CD25highT细胞比例越高，GVHD风险越大。二者不一致的原因可能是输入T细胞数量的差异造成的，后者T细胞中位输入量是前者的250%。这都说明，CD25high不是G-CSF动员后移植物调控性CD4 T细胞可靠的表面标志。CD4调控性T细胞缺乏可靠的表面标志，最近研究发现，编码核内转录因子的FOXP3（人为FOXP3）在CD4调控性T细胞的发育和功能上有重要作用。转导FOXP3的CD4 CD25-T细胞增殖活性下降，细胞因子分泌减少，表达GITR、CTLA-4等CD4 CD25 Treg细胞表面标志，而且具有抑制CD4 CD25-T细胞增殖功能；体内实验中，共同输注转导了FOXP3的CD4 CD25-T和CD4 CD25-T的RAG-/-小鼠产生CD4 CD25 Treg细胞，IL-10mRNA表达增高，健康存活，而空载体组出现严重的消耗性疾病。FOXP3及其编码蛋白特异表达于Treg，活化后的CD4 CD25- T的FOXP3及其编码蛋白的表达不足CD4 CD25 Treg的1%［3］。Khattri等［9］发现FOXP3的表达与外周CD4 T数量和反应成量效关系， FOXP3的表达量外周血调控性CD4 T功能有关。SYBR GreenⅠ实时定量PCR与普通PCR相比，具有敏感、快速、特异的特点。因无需合成特异探针，使用方便；但同时非特异产物可干扰靶基因的产物定量。分析 PCR 产物的融解曲线可以证实扩增产物的特异性，特异PCR产物在融解曲线上是单一峰，其Tm值较非目的产物高［10］。我们发现，FOXP3和β2-MG的融解曲线均仅有单一峰，Tm值分别为86.5℃和 82.3℃；琼脂糖电泳进一步证实了其扩增特异性。我们应用SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR方法检测了移植物FOXP3 mRNA的表达，分析CD4 CD25highT/总细胞数比例与FOXP3 mRNA表达水平的相关性，发现二者没有相关性，说明移植物CD25high不是调控性CD4 T细胞的标志。HLA相合同胞供者PBSCT中，无aGVHD组的FOXP3mRNA表达量是发生aGVHD组的318%（P=0.03）；BMT中，无aGVHD组的FOXP3 mRNA表达量是aGVHD组的708%，差别无显著性可能与样本量小有关。多因素分析排除aGVHD其他相关因素的影响，推测FOXP3 T细胞可减少aGVHD的发生。Miura等［11］检测了34例异基因骨髓移植患者移植后不同时期外周血单个核细胞FOXP3 mRNA的表达，发生GVHD组的FOXP3 mRNA相当于未发生组34.5%，相当正常人10.5%，而且与GVHD的严重程度成负相关，一些病人FOXP3 mRNA表达增高与GVHD好转有关。虽然很多研究证实FOXP3在调控性T细胞发育和功能中有重要作用，但FOXP3的表达调控机制仍不清楚。FOXP3可抑制NFAT和NK-κB等转录因子的活性，阻断IL-2、IL-4、IFN-γ等细胞因子的表达［12］。但由于调控性T细胞的抑制作用是接触依赖性的，FOXP3通过调控何种细胞表面分子发挥调控功能仍不清楚。总之，调控性T细胞可减轻异基因造血干细胞移植后aGVHD，但CD25不是CD4调控性T细胞的可靠标志，FOXP3特异表达于调控性T细胞，可作为aGVHD预测指标之一。
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发表于 2009-3-3 12:38
发表于 2015-5-21 15:01
