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作者：叶发刚，夏长所，张卫兵，夏仁云
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) M8 R; k1 L4 j, z, ?$ d( X. F2 k 【关键词】骨髓间充质干细胞;兔;离心法,梯密度;,细胞培养技术
/ v8 C2 l+ S& { O# F/ q0 S ［摘要］目的 优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、鉴定，同时对其生物学性状进行研究。方法取新生新西兰大耳白兔骨髓5.0 mL，采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对其进行纯化，观察细胞形态、超微结构和表面标志物的表达，从而对其进行鉴定。观察第1、3、5、8、10代细胞的增殖情况，并绘制出生长曲线。结果 经密度梯度离心、贴壁筛选并结合传代所得到的间充质干细胞很纯，第3代和第5代细胞形态单一，细胞排列具有典型的漩涡状结构。第1、3、5代细胞增殖能力强，生长旺盛;而第8、10代细胞增殖明显减弱。所分离培养的细胞表达CD44、CD90，不表达CD34，电镜观察为低分化细胞。结论 分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一，具有干细胞特性，第3、5代细胞很纯且其增殖能力强，适用于做以后的研究。
0 Q& N& z- L0 U; k8 f* {* a+ x ［关键词］ 骨髓间充质干细胞;兔;离心法，梯密度; 细胞培养技术
! Y- B2 v6 ]! I1 a9 x6 j APPROACHES TO ISOLATE， CULTURE AND IDENTIFY THE BONE MARROW-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS OF RABBITS
: c" z/ A" w* k YE FA-GANG， XIA CHANG-SUO， ZHANG WEI-BING， et al
/ @$ c" Q; t. j0 {- l （Department of Orthopaedics， Tongji Hospital， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030， China） 3 B# P# ?$ x$ B
［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the approaches to isolate，culture and identify the bone marrow-derived mesenchymal stem cells （BM-MSCs） of rabbits. MethodsBM-MSCs were isolated from the bone marrow （5.0 mL） of the newborn rabbit via density gradient centrifugation. Light and electron microscopy were used to study the morphologic features and immunocytochemis-try to examine the expression of cell surface antigens. The growth curve of cell proliferation was obtained based on the observation of the proliferation status of 1st， 3rd， 5th， 8th， and 10th generation. ResultsBM-MSCs of 1st， 3rd， 5th generation were very purified and all in the whirlpool-shape. They proliferated more rapidly than those of 8th and 10th generation. These cultured cells showed immunoreactivity to CD44 and CD90 but not CD34 and low-differentiation under the electron microscopy. Conclusion Purified BM-MSCs can be obtained via this protocol. Cells of 1st ， 3rd，5th generation with high proliferation are fit to the further experiment.
* j" t' _: t% L4 u1 Q ［KEY WORDS］mesenchymal stem cells; rabbits; centrifugation， density gradient; cell culture techniques8 j& P' }+ q. X$ L6 `
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell， MSC）是一种具有多向分化潜能的干细胞，特定条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等细胞分化［1］。但骨髓中MSC的数量有限，含量极低， MSC所占的比例非常小，通常105 ～106 个骨髓有核细胞中仅有1个MSC［2］。体外如何获取、纯化MSC并使其高效快速增殖是组织工程技术应用和推广的前提。本实验联合应用密度梯度离心和贴壁筛选的方法从骨髓中分离MSC并对其纯化，观察其在整个生命周期的形态、传代、增殖状态、细胞的超微结构及细胞表面抗原的表达，探讨体外分离培养MSC的生长规律，为大规模地获得生物学性状良好的骨髓MSC，进一步研究骨髓MSC的诱导分化和应用奠定基础。
# P7 I) }8 c2 X( P 1 材料与方法 1.1 实验动物 新西兰纯种大耳白兔1只（2月龄），雌性，体质量3.0～4.0 kg，由同济医学院实验动物中心提供，同济医学院附属协和医院实验动物中心饲养。 1.2 实验方法
- L9 p) G6 {# o$ Y/ F 1.2.1MSC取材与原代培养 将大白兔用3 g/L戊巴比妥钠（1.0 mL/kg）耳缘静脉麻醉后，侧卧手术台上，于髂后上嵴处剪毛备皮，体积分数0.01活力碘消毒，铺无菌洞巾，2 g/L利多卡因手术部位局部麻醉。16号骨髓穿刺针接10 mL注射器，穿刺进入骨髓腔，注射器内含稀释（3 000 kU/L）的肝素钠 1.0 mL ，抽取骨髓液约5.0 mL。细胞分离培养及传代按文献［3］方法进行。 3 O; d U+ [9 |
1.2.2MSC的生长曲线描绘 分别取第1、3、5、8、10代MSC， 用2.5 g/L胰蛋白酶消化后加入L-DMEM完全培养液，调整细胞密度至1.0×107/L，接种于5个24孔培养板中，培养板上作相应标记，每孔细胞悬液1.0 mL。每天每板取3孔消化，形成细胞悬液，混匀，行细胞计数并计算均值，连续9 d（消化8次）。然后以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。1 x- E- V# M0 b' U E9 q1 h
1.3 MSC的鉴定 ) E) }; i& x! F* ]
1.3.1形态学观察 在倒置显微镜下不定期观察细胞生长情况。
- t: C/ ]5 a6 w6 R+ I k 1.3.2超微结构观察 取生长状况良好的细胞2瓶，用2.5 g/L胰酶将细胞消化下来，800 r/min离心5 min，弃上清，加入约1.5 mL的L-DMEM完全培养液重悬细胞，移至1.5 mL的Ep管中，1 500 r/min离心10 min，弃上清，可见Ep管底下方有一粒约芝麻大小灰白色团块，沿管壁小心加入25 g/L戊二醛约1.5 mL固定2 h，再用锇酸溶液固定2 h，乙醇梯度及丙酮脱水，环氧树脂包埋，做成超薄切片，醋酸钠及枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察其超微结构。
+ x. [2 r% c* h* [% S% }; N" e( ^ 1.3.3细胞表面标志鉴定 收集第3代生长状况良好的细胞，传代培养于6孔板中行爬片，采用免疫化学ABC法检测CD34、CD44、CD90等抗原表达。
. }( b& f' j+ K! t4 j6 F9 b 2 结果
: d7 k$ \/ Q( L4 T* N, @# |% O. L 2.1 细胞分离经1.073 kg/L的Percoll分离液分离后，可以看到管内液体分为明显的4层。最上层约占液柱的1/2，为红色的培养液层;第3层约占液柱的1/2，为乳白色的Percoll分离液层;在两层的交界处为高约1.0 mm的灰白色云雾状层，为单个核细胞层（此层为所要的细胞层）;最底层紧附试管壁，为一薄层红色的细胞层，为密度较大的红细胞等。
' o5 ?7 A9 o# [) O 2.2 MSC的原代培养原代培养12 h后大部分细胞贴壁;2～3 d后细胞形态呈较一致的多边形、梭形;3～5 d后可见明显的集落形成，增殖速度快，集落之间互相靠近。 10～ 12 d左右细胞互相融合，达90%左右，此时细胞排列呈比较均一的螺旋状或漩涡状。
+ w% y. d1 G% Q: l+ W& d 2.3 MSC的传代增殖传代的MSC贴壁迅速，约3 h大部分细胞贴壁，细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核 仁清晰，核浆比例大。培养7 d即能达到90%融合，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。但随传代次数增多，细胞形态出现多样性，传代至第10代时逐渐呈老化现象，表现为细胞碎片的增多，细胞形态变为扁平，增殖速度明显减慢直至停止。通过对第1、3、5、8、10代MSC细胞计数，绘制的生长曲线呈S形，符合Logistic生长曲线（图1）。传代第1～2天为生长滞缓期，快速增长期约为第 3～ 6天，快速增长期结束后进入平台期。随传代次数增加，MSC的增殖能力开始减弱。第3、5代细胞增殖能力最强，第1代次之，第8、10代细胞和第3、5代细胞比较增殖能力明显减弱。
2 t0 S% m% b0 ]4 z 图1 第1、3、5、8、10代MSC的生长曲线（略）
+ q. [9 U4 @ f: S# ?& U 2.4 原代细胞透射电镜观察结果细胞核大，以圆形或类圆形为主，胞核比例大，细胞器少，为低分化细胞。
+ L$ Q) _' k+ a* ~ 2.5 细胞表面抗原表达免疫细胞化学染色见第3代细胞CD44、CD90染色呈阳性，胞浆为棕色或棕褐色;CD34染色呈阴性反应。说明我们所提取、纯化的细胞是MSC，而不是成纤维细胞或造血干细胞。0 M4 h2 w" w/ j
3 讨论
8 m3 J- N a! u$ l0 W( O0 L% ` 近年来对MSC的研究表明，它是一种具有多向分化潜能的干细胞，特定条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等分化［1］。它存在于骨髓、脐血和肌肉等多种组织中。骨髓MSC取材较方便，对机体影响不大，体外也便于分离，目前多从骨髓中分离得到MSC，但骨髓中MSC的数量有限［3］。体外如何获取、纯化MSC并使其高效快速增殖是组织工程技术应用和推广的前提。目前对MSC的分离纯化和扩增还没有统一的方案，其常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法［4］。在这4种分离方法中，由于流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法有较多不利因素，暂没有得到推广。密度梯度离心法是利用MSC与其他细胞的密度不同，用特定密度的淋巴细胞分离液将MSC分离出来，常用的淋巴细胞分离液有Percoll分离液和Ficoll-Hypaque（F-H）分离液两种，通过离心将骨髓细胞悬液分为明显4层，取含MSC的那一小层进行培养，所获得的细胞种类单一，细胞纯度高，可以满足组织工程研究的要求。Percoll和Ficoll-Hypaque分离液是两种分离介质，主要用于从液体中分离有形成分，两者的差别在于Percoll分离液的密度稍低于Ficoll-Hypaque分离液（1.077 kg/L）。有研究表明，两者都能减少分离细胞中成纤维细胞的比例，从而提高MSC的纯度，但由于Percoll分离液的密度（1.073 kg/L）稍低，在这方面作用更为明显，可以提高分离效果［5］。而且Ficoll-Hypaque分离液中含有较高的碘成分，对MSC的培养或多或少地造成不利影响，所以本实验分离MSC采用的是Percoll分离液。本实验在采用密度梯度离心法得到MSC后，采用贴壁培养法以及通过传代将MSC纯化，所得到的细胞形态单一，达到了我们实验的要求。其原理是首先利用MSC与其他有形成分的密度不同，通过密度梯度离心法有效地将绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板除去，获得纯度较高的单个核细胞。再通过贴壁培养和换液可除去悬浮生长的血细胞。通过传代3次，我们所看到的细胞形态一致，很少有杂质细胞，从而达到了有效的分离和纯化。但随着传代次数的增加，细胞表现为明显的衰老现象，细胞的增殖速度明显减慢，细胞形态变为扁平，细胞活力低下。通过观察发现第3、5代细胞增殖活力最强，第8、10代细胞活力明显降低，了解这些特点将为我们后期的实验打下基础，后期实验我们所选用的都是纯度高、增殖能力和活力最好的第3代或第5代细胞。 目前，关于MSC的鉴定也无统一的标准，MSC来源于中胚层，具有很强的自我复制和多向分化潜能。骨髓MSC的表面标志具有非专一特性，该细胞表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标 志，它对表面抗原SB-10、SH-2、SH-3、SH-4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD124等均呈阳性反应，而对造血干细胞的标志抗原CD14、CD34、CD35均呈阴性反应［6］。由于其表面标志的非专一特性，目前还没有筛选到MSC特异的分子标记。其鉴别主要依据形态学和表面标志相结合法进行综合判断［7］，从细胞形态看，MSC呈均一的成纤维细胞形态，贴壁生长为梭形、三角形，各代之间形态单一。透射电镜观察可见细胞核大、圆形，核浆比例大、染色质丰富，细胞器小，为低分化细胞。我们培养的MSC贴壁能力很强，细胞呈梭形，采用免疫细胞化学检查发现培养的细胞表达CD90，而不表达CD34，这说明培养的细胞是不同于造血干细胞的另一类干细胞。同时，其表达CD44且形态为单一的成纤维细胞形态，贴壁生长为梭形、三角形，更加说明我们分离、培养和扩增的细胞是实验所需要的MSC。1 ?1 Z; ^( S! a5 R
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o' M/ u9 c, s6 p$ o q （本文编辑 黄建乡）
" Z, P$ s% _$ P& ^! Y （华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北 武汉 430030; 青岛大学医学院附属医院创伤骨科; 南京鼓楼医院骨科） |
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发表于 2009-3-3 12:31
发表于 2015-5-24 17:08
