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作者：张翼 宋敬锋 白俊清
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' B3 k* R! j7 Q 【关键词】骨髓间充质干细胞；分化；软骨；组织工程
$ h1 {, N- w# `3 J 关键词骨髓间充质干细胞；分化；软骨；组织工程1 F4 r5 b7 I/ x/ F- m% o+ |
130 年前,德国病理学家Cohnhein 在研究创口愈合过程中首次提出骨髓中存在充质干细胞(BMSCs)的观点。近年发现,BMSCs具有向多种细胞系转化的潜能,自体获取的骨髓MSCs回输后不会发生免疫排斥反应,体外基因转染率高,因此BMSCs已成为组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面的研究热点。随着组织干细胞研究的兴起，特别是对组织干细胞可塑性的深入研究使得间充质干细胞的发育潜能，体外诱导分化、分离、筛选方法等的研究有了突破性进展。同时由于间充质干细胞在体内分布广泛，易于获得，并能在体外大量扩增，因此成为一种特别的组织细胞越来越引起人们的关注。* I: C0 _1 w0 f( i
1BMSCs的研究
% }% c! [; i S6 Y9 n 1.1BMSCs的分布骨髓中存在大量间充质干细胞，成为开展间充质干细胞研究最重要的来源。近2年，骨髓以外的间充质干细胞也不断被发现。首先,不同时期的造血器官、卵黄囊、主动脉-生殖嵴-中肾区、胎肝、脾等都有间充质干细胞的存在,发挥支持造血功能。2001年,赵春华的研究组从胎肝中分离到间充质干细胞，发现其与骨髓来源的间充质干细胞具有相同的分化潜能、表型以及生物学性状［1］。此后Baric等从骨滑膜组织，Young从胚胎、成人以及老年人的肌肉、真皮组织中分离到间充质干细胞［2］。因此人们认为这种成纤维细胞样的，具有多种分化潜能的间充质干细胞广泛存在于造血系统及结缔组织中。
2 p# Q$ J! G# \" V 1.2BMSCs的分离与培养目前,BMSCs的分离纯化及体外培养方法,由于各实验室的条件不同,许多实验室仍是在Friedenstein等的方法基础上进行一定的改进,即根据BMSCs易于粘附塑料底物的特性来实现分离，称为贴壁筛选法;根据BMSCs与其他细胞密度不同,采用细胞分离液来分离,即密度梯度离心法;根据细胞大小或者细胞表面的一些特殊标志来进行分离,即流式细胞仪分选法。目前国内采用较多的是利用密度梯度离心法来分离纯化BMSCs。现在国外较为关注的一种方法是依椐BMSCs对生长因子的反应性不同,通过选择适当的因子刺激增殖而获得含有较高比例BMSCs。在国外还建立了另外一种简单经济高效的分离BMSCs的方法,即利用一种具有3μm孔径的塑料培养皿从骨髓中筛选BMSCs,这种方法筛选出来的BMSCs均质性＞98%,也具有自我增殖和更新及分化为各种结缔组织的能力［3］ 。
|/ Q! a2 _9 \: Z+ \( L3 _- l 1.3BMSCs的主要生物学特性骨髓中只含有少量间充质干细胞,仅占骨髓细胞的0.01/万～1.00/万,并随年龄的增加而减少。体外单层培养的间充质干细胞外形类似成纤维细胞,呈长梭形,体积较大。原代细胞接种附壁后形成2～4个细胞的灶,经过2～4d的潜伏期后开始迅速地克隆性扩增,类似旋涡状盘旋排布,10～14d可接近融合,经传代的细胞形态更一致,对数增长期细胞倍增时间为33～38h。体外培养合成的细胞外基质蛋白主要包括Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原、基膜粘连蛋白等。一般认为,BMSCs的特征性标志主要有SH2、SH3、SH4、SB210抗原等,而CD14、CD34、CD45则为阴性［4］。具有强大的增殖扩增能力是BMSCs一个重要的生物学特征。Conget等［4］检测人BMSCs中约有20%的细胞处于静止期(G0期),足以维持增殖分化所需的细胞供给。以7 000个/cm2接种，4d传一代，每代扩增2.4 倍,传至20～25代,细胞形态、生长曲线、免疫表型仍无明显变化,至此每个单一的BMSCs已大约扩增为5.5×108个细胞;在此以前未观察到细胞凋亡特点,但20～25代以后则出现典型的凋亡表现。Colter等［5］报道极低密度培养能保持BMSCs的增殖能力,20ml的骨髓样本经3代6周的培养可扩增2×109倍,达1013个细胞,相当于成年人体细胞总数。具有多向分化的能力是BMSCs最重要的生物学特征,已被近几年来的大量研究所证实。在适宜的体内或体外环境下,BMSCs不仅可以分化为间充质组织,还保持有内外胚层的组织发育分化潜能,可以分化为神经系统、肝脏、肺脏、上皮组织等。Friedenstein首先证实了BMSCs具有分化为骨、软骨、纤维组织的能力。Ferrari等［6］观察到BMSCs可以迁徙入肌肉并分化生成为完全的肌纤维。Liechty等［7］将人BMSCs移植入早期妊娠的胎羊,异种的细胞入住多种组织存活达13个月,并按接种部位特异性地分化为软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、心肌细胞, 说明BMSCs不仅保持了多分化潜能且具有独特的免疫学特性。
1 L- f/ o0 Q+ F$ ~% a% t 2BMSCs向软骨方向的分化
% X; i7 n0 g3 F4 o6 i 2.1在BMSCs向软骨分化过程中基质作用的研究细胞分化需要细胞与细胞、细胞与基质间相互作用。有学者将单层培养用于BMSCs大量扩增阶段，也有学者在单层培养下对BMSCs定向诱导分化。Worster等［8］对来源于马的BMSCs定向诱导成软骨细胞, 检测到软骨细胞特征标识物及观察到软骨细胞形态的细胞,但未观测到软骨样组织形成。Yoo等［9］对体外单层或细胞聚集球培养下的成人BMSCs进行比较,发现在其他条件相同时,三维培养的BMSCs发生了定向软骨分化,而单层培养,则无软骨形成。三维立体环境能容纳高密度的细胞粘附、增殖,有利于细胞间信号传递,为维系细胞的代谢活动提供适宜的微环境。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)可良好地固守在细胞附近,而不像单层培养易于流失到培养液中,因此ECM对细胞增殖分化及代谢的调节作用,在三维培养中得以充分发挥。! _4 f' F" y7 L8 r
2.2载体在BMSCs向软骨分化中的应用近几年来, 以不同种属来源的BMSCs接种于多种支架材料,在体外构建工程化软骨也相继获得成功。Martin等［10］(1998年)首先将鸡胚BMSCs经单层培养扩增后接于聚羟基乙酸支架培养4 周生成了软骨组织。在10% FBS基础上加用bFGF扩增的BMSCs接种于支架后产生的三维组织均质性更高,且有更高的湿重和糖胺多糖含量,干湿重比例、糖胺多糖、胶原含量与骺软骨含量相似,生化成分、组织学结构在种子细胞不同接种数量(1×106,3×106,5×106)之间无明显区别。Ponticiello等［11］(2000年)将人BMSCs接种于明胶海绵,在加用TGF-β3(10mg/L)的化学限定性培养基中培养21d生成了软骨组织,观察表明细胞的接种密度影响细胞产生细胞外基质(硫酸糖胺多糖及Ⅱ型胶原)的能力,以1.2 ×106个/ml的密度最为有效。Majumdar等［12］(2000年) 将扩增三代的人BMSCs以2.5 ×106个/ml的密度包埋于海藻酸盐珠中,用无血清培养基加用100nmol/L的地塞米松和10μg/L的TGF-β3培养3周,Ⅱ型胶原免疫组化为阳性,Ⅱ型胶原mRNA表达量可比未行TGF－β3 处理的增加9倍。将BMSCs掺入Ⅰ型胶原凝胶经体外培养同样可以分化生成软骨。
/ W* S# |' i' P# h" F/ e 2.3诱导因子在BMSCs向软骨分化中的应用Denker等［13］发现,添加多聚阳离子化合物或多聚L-赖氨酸等引起细胞聚合的物质,能促进骨形成蛋白-2(bone morphogenetic- proteins-2,BMP-2)诱导BMSCs定向分化为软骨细胞。诱导因子在BMSCs的定向分化为软骨细胞过程中起到了非常关键的作用。许多学者在实验中用TGF-β1、TGF-β3诱导出了软骨细胞,而无诱导因子的无血清培养液则不能。TGF-β1的诱导作用与剂量相关,且诱导的软骨细胞为中间阶段,将继续分化成其终末表型-肥大软骨细胞(hypertrophy chondro-cyte )［14］。TGF-β3与BMP-6有协同作用［15］,TGFβ-1与BMP-6、地塞米松及胰岛素均有协同作用［14，15］。TGF-β3与地塞米松在无血清培养液中,可以诱导三维培养状态下的BMSCs定向分化为软骨细胞,如果在已诱导分化的软骨细胞中加入甲状腺素,减少地塞米松的剂量,当去除TGF-β3后则可以进一步诱导分化成肥大软骨细胞［16］。
( e, b: {7 r5 Z: Z 3BMSCs在软骨组织工程中应用的几个问题- L& O8 y; e, h
1）用自体的软骨细胞修复软骨缺损存在一些不易解决的问题。例如,软骨细胞相对稀少,体内来源有限,体外的大量扩增会导致种子细胞的老化和生物学功能的退化,供区的远期并发症是否存在还有待于证实;两次外科手术的费用昂贵等。异体软骨细胞移植的免疫排斥问题短期内还难以得到满意的解决,目前还尚无可供异体移植的细胞库。BMSCs因其获取容易、创伤微小、具有强大的体外扩增能力和很好的多分化潜能,而受到组织工程研究者的青睐。Wakitani等［17］1994年首先报道了用体外纯化培养的自体骨髓MSCs掺入Ⅰ型胶原凝胶修复兔膝关节软骨大的全厚缺损,术后2周即形成透明软骨,24周缺损的关节软骨和软骨下骨得以修复,但修复的软骨比正常关节软骨薄,有些区域缺乏软骨蛋白多糖着色,与周围软骨融合仍不完全,力学测试结果低于正常软骨,而采用来源于骨膜BMSCs的效果更差。1996年Miriam等［18］以高密度培养诱导软骨细胞表型后,将BMSCs掺入2%的高分子量透明质酸进行自体移植修复羊膝关节软骨缺损,3个月后形成了组织结构与正常关节软骨相似的透明软骨,但形态结构仍有差别,其最终的转归还需更长时间的观察。异体移植则产生纤维瘢痕样组织,有明显的免疫反应。2）如何调控BMSCs定向分化成软骨细胞, 使其分化的初级软骨细胞分化为成熟软骨细胞, 并抑制其向肥大软骨细胞分化,这也是目前软骨组织工程学中的重要问题。这需要更深入的研究了解BMSCs分化机制,从而指导调控。其分化途径有如下阶段:间充质细胞凝聚→软骨细胞增生→肥大软骨细胞前体细胞→肥大软骨细胞,最后软骨细胞凋零,组织被骨所替代［19］。此过程需多因素参与,包括多种细胞因子及细胞受体,转录因子,细胞内信使和由潜在的基因调节的正负反馈过程。目前,相关的研究表明:参与此分化途径的细胞因子包括:TGF-β超家族及其受体、FGFs及其受体、甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)及PTH/PTHrP受体、IHH(indian hedgehog)。其中PTHrP与IHH构成负反馈调节机制,IHH主要在肥大软骨前体细胞中表达,可激活PTHrP表达;PTHrP抑制软骨细胞向肥大软骨前体细胞分化。PTHrP/IHH构成的负反馈环调节增生状态下的软骨细胞向肥大软骨细胞分化,而TGF-β是通过刺激PTHrPmRNA的表达,调节向肥大软骨细胞分化的速度［20］。低浓度的bFGF可稳定软骨表型, 抑制软骨细胞分化成肥大软骨细胞。3）适合于BMSCs的组织工程基质材料同样是目前研究的难点。理想的软骨组织工程基质材料应具备以下特点:①良好的生物相容性,其本身或降解产物对种子细胞和机体无毒性,不会引起炎症和免疫排斥反应。②适宜的生物降解性,降解速度需和组织再生速度相匹配,最后可完全吸收。③良好的结构相容性,具有一定的强度和可塑性,能保持稳定的三维立体结构,最好能通过关节镜植入。④良好的表面相容性和一定的生物活性。材料表面有利于种子细胞的粘附与生长,并能通过表面修饰、控释生物分子或对环境刺激作出响应等机制对种子细胞的粘附和生长进行调控［21］。Ponticiello等［22］的观察表明,明胶海绵适合成人BMSCs的软骨分化,且将其植于兔的骨软骨缺损处观察到很好的生物相容性,无免疫反应和淋巴细胞浸润的证据。Johnstone等［23］联合应用透明质酸和明胶制作了一种坚固而有高孔率的基质材料,可以观察到BMSCs在其内全面的软骨细胞分化。目前,常用的软骨组织工程基质材料按其来源可分为人工合成和天然材料二大类,合成材料主要有:聚羟乙酸(PGA)、聚乳酸(PLLA、PDLLA)、聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(PL-GA)、透明质酸(HA)、藻酸钙凝胶、聚氧乙烯水凝胶、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(Pluronic)、聚丙烯延胡索酸盐(PPF)、聚酐、聚磷酸酯等。天然材料有胶原(Ⅰ或Ⅱ型)、纤维蛋白凝胶、硫酸软骨素、脱钙骨基质(DBM)、明胶等。按其形态结构可分为纤维网状、海绵状和凝胶状等。这些基质材料各有其优缺点,其中PLGA、HA、Pluronic、PGA/PLLA、PDLLA等在软骨组织工程研究中显示了良好的性能而被广泛接受［24］。4）防止受者免疫系统对移植物的排斥是组织工程面临的另一项挑战。组织工程移植物和传统的器官移植物既有相同之处,也有自己的特点。与一般的器官移植一样,可以针对受者免疫系统,利用免疫抑制剂如糖皮质激素、环孢霉素、OK-T3 等来抑制受者的免疫功能,也可通过诱导受者对移植抗原的免疫耐受而提高移植物的存活率。但对于组织工程产品,还可以通过改变移植物的免疫特性来降低其抗原性,从而防止或降低免疫排斥反应的发生［25］。组织工程移植物可通过以下途径降低其抗原性:供者细胞的免疫改造,细胞移植的排斥反应是从移植抗原的递呈和识别开始的,因此移植前设法去除混在移植细胞中的抗原提呈细胞如巨噬细胞、树突状细胞、血管内皮细胞和淋巴细胞等,可以在某种程度上防止排斥反应;供者细胞的免疫隔离,即把供者细胞包埋在由半透膜材料制成的装置中,以隔离受者的免疫细胞和抗体与移植的细胞接触,防止了免疫反应的发生。最典型的例子为免疫隔离的胰岛细胞移植;供者细胞的基因改造,即通过改变供者细胞的基因,使其不易被受者免疫系统识别和攻击,或者利用胚胎干细胞技术和核移植技术,创建与受者基因完全一致的胚胎干细胞,用于制备细胞或组织移植物［26］。4 C+ x0 l# _! m
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正是由于BMSCs具有良好的多组织分化潜能和高增殖活性,获取方法简便易行,便于自体移植,故在组织工程领域展现了其良好的应用前景。但就软骨组织工程而言,有关BMSCs在很多方面还需要进一步研究,一些基本的问题需要给以准确的回答。例如,BMSCs经体外大量扩增后如何能很好地保持多能干细胞的生物学特性;BMSCs分化为软骨组织,是软骨内成骨的中间过程还是终极分化;BMSCs的软骨细胞表型分化和维持的关键外部刺激信号和信号传导途径等等。随着BMSCs各方面研究的不断深入,相信在不久的将来它很可能成为组织损伤修复的有力工具。5 {1 {8 _7 a, i ^$ G/ e [5 M8 m* F
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