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应用MRI活体示踪干细胞心肌移植可行性的实验研究

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发表于 2009-3-3 12:26 |显示全部帖子
作者:马翔, 马依彤, 马艳, 侯月梅, 武云,  张健发,王俭, 易华作者单位:新疆医科大学第一附属医院
9 G( c/ {3 V: N9 j6 G                  : N( @( E7 K  v( b; |' \, \
                  
5 @; z! E; ^1 m5 k          , F5 v$ x% N3 J1 {5 ~" J
                        
+ K/ G0 Z# N# h: K            ' {9 A" Y" Y2 |/ S
                    % @( T# z6 _; A
            
7 A: r0 X1 y7 c. ^3 L                     
3 Z" Z+ M# D, ]5 R# H        5 k' ^0 s, l* w
        4 Q1 l; R  |: M' [9 k
        
& E  n. R3 X$ R- W          【摘要】  目的:探讨应用MRI活体示踪干细胞心肌移植的可行性。方法:选择8只雌性家猪,体重35~45 kg,经导管应用球囊封堵前降支动脉建立心肌梗死模型后,将存活的7只随机分为Feridex标记的干细胞移植组(n=4)和Feridex未标记的干细胞移植组(n=3)。建立模型2周后开胸,在梗死区中央及梗死边缘区共5个点注射骨髓间充质干细胞(BMSC)(1.25~7.54×106)。于移植前及移植后1 h、1周、2周分别行心脏MRI 检查,比较移植前后MRI心脏影像学变化。移植后2周,取心脏组织行HE染色和普鲁士蓝染色。结果:移植后1 h,Feridex标记的干细胞移植组中4只动物(100%)间充质干细胞移植区在MRI上呈明显的低信号改变,术后1周示心脏低信号改变达100%(4只动物),术后2周示2只动物(50%)细胞移植区有低信号改变。病理检查示梗死区内大量炎性细胞浸润,Feridex标记的干细胞移植组心脏注射点处的组织普鲁士蓝染色阳性。结论:Feridex标记的干细胞在MRI上呈低信号改变,应用MRI活体示踪BMSC是可行的。
( A# W' e( H, M& r          【关键词】干细胞; 移植; Feridex; 核磁影像1 F" P& m/ e4 J4 I/ n/ }
                    Investigation of feasibility of in vivo tracking stem cell with MRI
* P! E4 Q3 m7 Z
& e6 I( y* g8 F, r: T% p5 g0 e  MA Xiang,MA Yitong,MA Yan, et al; o) L7 v0 S! n! ?

. [2 L) T  M& K* @4 k  (Department of Cardiology, First AffiliatedHospital, Xinjiang Medical University,Urumqi 830054, China)
* e" }) a; a( P( d
( M% T# G  B6 d1 \' G3 k' `: U  Abstract: Objective: To investigate the feasibility of in vivo tracking for mesenchymal stem cell delivered to infracted myocardium by MRI. Methods: Eightpigs, weight 35~45 kg were used. The acute myocardial infarction (AMI) model was set up by occlution anterior descending coronary artery with balloon. The bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) that labeled by MRI contrast Feridex were injected into myocardium of 4 pigs while stem cells without labeling were injected in to other 3 pigs. The heart was checked by MRI before transplant, one hour, one week and two weeks after transplant. The pigs were sacrificed for histological examination and Prussian blue stain two weeks post MI. Results: The mesenchymal stem cells were transplanted successfully at 7 pigs. Injection sites in group injected with Feridex labeled stem cells can be tracked by MRI in all 4 animals after one hour of transplant and the same rate after one week of transplant. After two weeks, injection sites in this group still can be find by MRI in 2 animals. But there are none injection sites in other group can be found by MRI post operation. Prussian blue stain is positive in the injection sites of the group that injected with Feridex labeled stem cells. Conclusion: In vivo tracking Feridex labeled stem cells by MRI can be an effectively and feasible way.
: T0 m, H$ b6 z, C& S
  i% V5 [' w! p& w- h* u  Key words: stem cells; implantation; feridex; magnetic resonance imaging
/ A- ]: {3 l9 j" {- F* O9 y& M  P7 U; k4 F& g
  应用干细胞移植修复治疗心肌梗死已经成为近几年再生医学研究的热点[1,2]。有关研究均已证实,胚胎干细胞、祖细胞及间充质干细胞等具有一定的修复心肌的作用[3] ,但最终的评估需要活体示踪技术来提供细胞定位及定量的客观证据。近年来,随着影像设备的发展,活体示踪移植干细胞,探索影像学评估移植细胞动态变化的趋势已成为一个研究方向[4,5]。为探讨应用MRI活体示踪Feridex标记的骨髓间充质干细胞(BMSC)心肌移植的可行性,本研究对建立的家猪心肌梗死模型注射BMSC进行心脏MRI检查,比较移植前后MRI心脏影像学变化,现报道如下。
0 T, Z' z" {; P1 I& S
! E& B5 w: A  a% G* j/ m  1材料与方法
0 Z3 Q  \( w1 `# }) I( X# z; U9 S- {' Y6 `  A
  1.1动物心肌梗死模型的建立
* t" N3 D: T6 G5 P% @+ R, e, q8 m/ ~6 q" l: s
  选择8只成年雌性家猪,体重35~45 kg(由新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供),经检验均为健康合格实验用动物。麻醉后,建立机械通气。在X线导引下,以7F Amplazter R2 Guiding导管至左冠脉开口处,将2.5 mm20 mm球囊(Marverik)送至前降支动脉中段,以2~3 atm扩张完全封堵冠脉,持续60 min。以心脏二维超声检查证实局部心肌运动明显减弱或消失、心电图示相应导联出现病理性Q波为心肌梗死模型建立成功。模型建立成功后,将存活的7只动物随机分为2组:Feridex标记的干细胞移植组(n=4),Feridex未标记的干细胞移植组(n=3)。
! z# _! b3 k& @" Z/ b7 B4 A
; s7 ?7 I, P( e! U  1.2BMSC的制备
/ @2 U  s7 T3 Z$ e) k  ?) R& i' K7 S( d; s% \+ v! |
  心肌梗死模型建立前1 h,动物取俯卧位。在无菌条件下,使用常规骨穿针,在双侧髂后上棘穿刺,抽取80 ml骨髓血。按照文献[2]的方法进行BMSC的分离及培养。通过50 μm滤网去除大的颗粒后,经梯度离心分离单个核细胞,注入培养瓶中(Coring),加入高浓度的DMEM 培养基(Gibco)培养。
6 `* y& G  r0 R: [. u& J# v/ j& ]: Z; [9 ?# y* U
  1.3BMSC的标记: ]8 L& ~5 F* P, }

+ d' \& i9 Z8 P: Z' M  单个核细胞培养、扩增2周后,使用Feridex多聚赖氨酸(polyLlysine,PLL)混合物标记,按25 μg Feridex加入1 ml的DMEM培养24 h,使细胞终浓度为(2~8)106/ml,取20 μl细胞悬液检测Feridex标记BMSC的有效率[6]。同时光学显微镜下观察含铁血黄素染色后的细胞形态。) f! h& p. r, B: J
8 f" G# Z$ [: u7 A
  1.4BMSC的移植. I5 r7 R; E0 g' G; f
4 F3 q/ W! D! t
  心肌梗死模型建立2周后行干细胞移植。动物麻醉后,经左侧第5肋间开胸。分离皮肤、皮下组织及肌肉,打开胸腔,暴露心脏,分离心包,完全暴露左室。使用1 ml注射器、27G针头,在梗死区中央及梗死边缘区注射BMSC[(1.25~7.54)106]。每只动物注射点为5~10个,共注射细胞悬液1 ml。
- o6 ^- Y- F. p/ N* T* Z, L, R
) Y% I, e+ N  v  1.5心脏MRI检查
  ?+ s* ?" D, \& a: F
$ g: V" w( W3 s. y/ A. H) y# A; L0 f  所有动物在心肌梗死模型建立前及移植后1 h、1周、2周,使用1.5T 核磁影像机(GE Medical Systems,sigma 11.0)行心脏检查。在扫描时使用心电门控,在心脏舒张中期行扫描获得影像。以灌注缺损及延迟灌注增强的组织作为梗死心肌,观察梗死区中央及梗死边缘区的细胞移植区有无低信号改变。  j' ^, U5 Z4 y' Y0 E
& A1 N; Z; |& Q5 D0 f% ]  S
  1.6组织学检查
# ?4 L& F0 g  k2 s3 [+ C, Q- ~% a' k9 _5 `* j( m
  心肌梗死后2周处死动物,取出心脏,从梗死区、非梗死区、交界区取组织,以多聚甲醛固定后制备4 μm厚石蜡切片,行HE染色及普鲁士蓝染色,观察细胞移植后的心肌组织中有无新生细胞、炎症和纤维增生。/ q7 {: x! m( N2 l( T% o

4 X$ {  a4 h6 U; p  1.7统计学处理
- ?, a% [4 _. m/ q8 g6 ?/ E& h* u- D8 x/ a* l
  应用SPSS 11.0软件包进行统计学分析,所有计数资料以均数±标准差(±s)表示,计量资料采用t检验,计数资料采用卡方检验,检验水准α=0.05。' k7 m3 J# B! y5 G3 G/ {

  z2 R5 P3 J; E; l  2结果
& H: `9 p1 _  ~) V, v0 a
( R5 A- R. Z" o* _6 y  m# U  2.1手术结果
" ?. \9 Y( U9 ]4 g
5 E1 F) b9 l9 ^+ \  在建立心肌梗死模型过程中有1只动物发生顽固性室颤死亡,7 只动物成功建立心肌梗死模型并成功移植BMCS。心电图证实其中5只为前间壁心梗,2只为广泛前壁心梗,均出现急性心肌梗死典型图形变化。* \7 S% O: t2 \3 u

- Q  j# l' ?/ N6 P/ z+ q' m9 T  2.2Feridex标记' J# ?/ R2 G& e* F( R( Y5 i
: ?/ W6 n+ G8 B; e6 v: A+ t2 N) T
  BMSCBMSC的存活率在标记前为(95.6±4.2)%,标记后为(89.1±6.7)%,差异无统计学意义(P>0.05)。Feridex标记BMSC的有效率达(80.5±8.2)%。镜下观察发现Feridex 可以有效与骨髓间充质干细胞结合,主要分布在细胞核周围(图1)。经含铁血黄素染色后,细胞核染成红色,胞浆中可见大小不一的蓝绿色颗粒(图2)。& ^1 U: a" c1 x+ ~

2 L$ {8 B2 D8 c: _4 L# t  2.3MRI检查结果
9 q8 Q' i  U) q$ U+ A5 y$ C7 r7 w2 R- U$ j+ _! |' R  @
  在建立心肌梗死模型后, MRI检查显示,7只动物前壁及心尖部均有灌注缺损区,延迟显像强化,提示心肌梗死模型成功建立。移植后1 h,MRI检查示Feridex标记的干细胞移植组4只动物均有明显的低信号改变(100%)(图3)。术后1周示心尖部低信号改变仍达100%。术后2周2只动物心尖部有明显的低信号改变(50%)。8 r  G, e/ O" Q% C( }  k  r* {" I

1 h" z: s& ~, C  2.4组织学检查结果3 r2 c" I, }, H5 ^" o3 T: E7 M# i, ?5 @

% Z! p' g! E/ ^; ~7 e; o- h  2组动物心脏HE染色显示梗死区心肌细胞溶解,特有的心肌结构消失,提示心肌梗死模型建立成功(图4)。大体标本可见心尖部梗死区室壁明显变薄,Feridex标记的干细胞移植组移植部位可见暗褐色移植物。移植后2周与Feridex注射部位对应的组织普鲁士蓝染色阳性(图5),提示Feridex移植入心肌后,2周仍在体内存留。
+ V) e' |1 ~. X$ b+ b2 ^1 T: f# h: p3 X, G- A( @8 Q# b
  3讨论
- Y9 z- V5 ]2 E  {8 b; O
  z8 ^/ Q6 S- B6 j0 |  随着BMSC在治疗心血管疾病领域的广泛研究,安全、有效的活体细胞示踪检查成为热点。临床研究中理想的影像技术应有以下特点[7]:(1)生物学相容性强,安全,无毒;(2)对干细胞无基因修饰;(3)可检测在任何解剖位置的单细胞;(4)移植细胞的定量分析;(5)细胞分裂后不减少或轻微减少;(6)标记物不与或极少与非干细胞结合;(7)移植后几个月至几年内,活体非侵入性影像检查;(8)不需要注射标记物。至目前为止,还没有任何一种影像技术达到以上8种条件。研究提示,MRI检查是细胞毒性小、空间分析性强、可以达到亚器官水平、动态提供移植后细胞组织相互作用三维结构影像信息的有力方法[8~10 ]。近年来,已有应用MRI延迟对比增强影像技术评估梗死心肌修复动态变化过程中的监测作用。马剑英等[11]报道应用磁共振成像的首过及延迟增强技术评价心肌梗死,能够清晰显示梗死心脏的范围,且MRI心肌灌注在一定程度上反映了新生血管的情况,也是评价疗效的一项有用指标。本研究中MRI检查显示,建立心肌梗死模型后7只动物前壁及心尖部均有灌注缺损区,延迟显像强化,结果与病理检查相符,提示心肌梗死模型成功建立。Feridex(ferumoxidex)是一种超顺磁性氧化铁葡聚糖水胶体,易被网状内皮细胞吞噬[7~9]。Bos等[10]应用Feridex标记BMSC移植到动物的肾脏和肝脏后行MRI随访,结果表明Feridex是一种具有高敏感性、高识别和高分辨率、适合人体内追踪的理想造影剂。本研究中,BMSC与Feridex混合培养后,BMSC在标记前、标记后的存活率无明显差异,且标记细胞的形态未发生特殊改变,细胞活力未受影响,表明Feridex标记BMSC对细胞的功能影响较小,这与Dara等[9]的研究结果相似。MRI检查示移植后1 h,Feridex标记的干细胞移植组心肌梗死区注射点低信号改变达100%,术后1周示心脏注射点低信号改变达100%。提示Fridex是一种细胞毒性小、具有能够满足MRI 示踪需要的标记性能,并且能够与移植细胞较长时间结合便于追踪的MRI造影剂。术后2周示心脏注射点Feridex显影率仍达50%,表明MRI 可以准确检测到活体心脏中Feridex标记的BMSC。移植后2周与Feridex注射部位对应组织普鲁士蓝染色阳性,提示Feridex移植入心肌后,2周仍在体内存留。BMSC移植到心脏后,部分细胞死亡释放Feridex,这些氧化铁成分将被巨噬细胞摄取。因此,在BMSC移植后的一段时间内,MRI检查结果的改变不能简单的解释为移植细胞的移行,也可能是巨噬细胞的作用。总之,应用核磁共振造影剂Feridex 标记猪骨髓间充质干细胞,行心脏MRI检查,活体示踪心肌干细胞移植是可行的。
5 c7 ~: b  I9 z4 {2 H          【参考文献】
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  [5]Aicher A, Brenner W, Zuhayra M, et al. Assessment of the tissue distribution of transplanted human endothelial progenitor cells by radioactive labeling[J]. Circulation, 2003,107:21342139.
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/ t& n. g: H9 ]* i3 i* F& ~  [7]Frangioni JV,Hajjar RJ.In vivo tracking of stem cells for clinical trials in cardiovascular disease[J]. Circulation, 2004,110:33783383.
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/ v3 [& o# ~8 Q

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3 g3 v) d! ^, }1 k( `" N

, e& {. D, Q  R0 o
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& Q9 o# y/ @/ z8 r2 n
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, g, k; ~% n/ x* s* H: N" N* y4 H2 Y- A! O3 j

0 P1 J! W6 Y8 Z) ~- V9 n, v! `4 y/ v' d5 C
  [11]马剑英,钱菊英,葛均波,等. 首过及延迟增强的磁共振成像技术在心肌梗死中的价值[J].中华心血管病杂志, 2005,33:14.

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