影响脐血多能非造血成体干细胞分离的相关因素研究 - 国内文献区干细胞之家



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发表于 2009-3-3 12:17 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

作者：李云涛，徐燕，孟恒星，葛薇，李桥川，万长春，于珍，李长虹，邱录贵作者单位：中国医学科学院中国协和医科大学、血液学研究所、血液病医院；基金项目：天津市科技发展计划项目，编号 043803111

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         , {" l$ x5 M0 T$ g8 r1 i* z2 Q5 {
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      【摘要】  　　为了研究低血清条件下从脐血中分离多能非造血成体干细胞的相关影响因素，探索优化培养条件，通过不同培养液、接种密度、首次换液时间对脐血多能非造血成体干细胞生长的影响的比较，并以选定的条件对其培养扩增，进行免疫表型及诱导分化能力检测。结果表明：在低血清条件下，DMEM/F12培养液更适合于脐血多能非造血成体干细胞生长； 1×106／cm2是原代培养的适宜接种密度，原代第72小时首次换液为最佳换液时问。利用所选条件培养的细胞可在体外持续扩增，并具有良好的分化潜能。结论：建立了人脐血多能非造血成体干细胞的体外优化培养条件，为其在组织工程方面的应用作出了新的探索。 5 _/ U* c) }7 S) B2 H6 ]- v) C
      【关键词】干细胞；多能非造血成体干细胞；  脐血；分离效率; v( X! {5 ?3 q7 y: n' c
   　　Related Factors Affecting the Isolation of Multipotent Non-hematopoietic Adult Stem Cells from Umbilical Cord Blood

　　LI Yun-Tao，XU Yan，MENG Hen-Xing，GE Wei，LI Qiao-Chuan，WAN Chang-Chun，YU Zhen，LI Chang-Hong，QIU Lu-Gui5 c9 T1 ~; O$ h+ t! l) t

　　State Key Laboratory of Experimental Hematology，Institute of HematologyandBlood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical University，Tianjin 300020，China

　　AbstractTo investigate therelated factors affectingthe isolation of multipotent non-hematopoietic adult stem cells (MNASCs) from human umbilical cord blood in low serum (2%) condition，the isolation conditions were optimizedandthe yield of MNASCswas improved.MNASCs from human umbilical cord blood samples were isolated，and the effects of medium component，medium exchange time and initial plating density for isolation of MNASCs were studied. Then，the MNASCs were isolated and cultured in optimal condition，the surface antigen expression and differentiation potential of MNASCs were detected. The result showed that the medium of DMEM/F12 was better than IMDM and DMEM-LG for MNASCs culture in low serum condition. The optimal yield of MNASCs was obtained when mononuclear cells were cultured at a initial plating density of 1106 cells／cm2 and the medium was exchanged to remove the nonadherent cells after 72 hours of inoculation. MNASCs isolated and cultured under the above-mentionedconditions maintained a homogenous morphology，high potential ability of expansion and differentiation. It is concluded thatculture conditions with low serum defined in this study is optimal for the successful isolation and expansion of umbilical cord blood MNASCs with high numbers for subsequent cellular therapeutic approaches.9 {# b" v4 n7 S9 Y% X! c
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　　Key wordsstem cell; multipotent non-hematopoietic adult stem cell;umbilical cord blood;isolation efficiency
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近年来一些研究发现，脐血中存在具有多向分化潜能的非造血成体干细胞(multipotent non-hematopoietic adult stem cells，MNASCs)。这类细胞可在体外培养扩增，并且能够分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多种组织细胞［1，2］。由于脐血干细胞具有资源丰富、增殖和自我更新能力强、免疫原性弱等优势，对其进行开发和应用将对干细胞组织工程及其应用具有深远意义。  l# ~. [0 `7 e# o% ]9 j/ A
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目前从脐血中分离多能非造血成体干细胞多数仍然沿用Friedenstein等建立的贴壁传代分离培养的方法，即利用不同细胞成分在塑料介质上黏附特性的差异，借助换液去除不贴壁的杂质细胞，传代纯化。本研究对利用这一方法在低血清条件下分离脐血多能非造血成体干细胞的相关影响因素进行了探讨，结果表明所用培养基种类、起始接种密度、初次换液时间等都是影响分离的重要因素。

　　材料和方法

　　脐血多能非造血成体干细胞的分离和培养
8 w7 X# s% H! V
　　将脐血以PBS缓冲液2倍稀释后，用淋巴细胞分离液（相对密度为1.077），400g，离心20分钟，分离单个核细胞（MNC），洗涤后重悬于DMEM/F12培养液（Gibco BRL公司产品）中，计数细胞，用含2%胎牛血清（FBS，天津灏洋生物公司产品）、40% MCDB-201（Gibco BRL公司产品）、10 ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，PeproTech产品）、1胰岛素－转铁蛋白－亚硒酸钠（ITS，Gibco BRL公司产品）的DMEM/F12培养液稀释，以1106/cm2的细胞密度接种于6孔板中。置于饱和湿度、5％ CO2的37℃培养箱中培养，72小时后换液，弃去非贴壁的细胞，以后每周换液2次，第14天计数集落数，超过50个细胞计为集落。当细胞达到70％－80％融合时，以含0.25％胰酶－0.1％EDTA的消化液消化，计为P0代细胞，传代培养。在检验培养基的影响时，脐血MNC分别以IMDM、低糖DMEM（DMEM－LG）、DMEM /F12培养基进行培养；检验接种密度的影响时，脐血MNC分别以1105/cm2、5105/cm2、1106/cm2、2106/cm2密度接种；检验初次换液时间的影响时，分别于接种后24、72、120小时换液；其它条件均不变。, X+ a, J7 r% W* z* m$ k  h8 F. z6 c

　　P2代细胞集落形成及检测* U* p7 |2 d9 ?* I7 S7 O+ K/ ^' \
! ?4 \9 T; V: x3 N1 S+ D
　　在各个培养条件下获得的P2代细胞以10/cm2密度接种于培养皿中，培养14天后，以95％乙醇固定，加入1％结晶紫染色，显微镜下计数集落，超过50个细胞计为集落。结果以每100个细胞形成的集落数（%）表示。7 I  c' C2 }$ K' ~
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　　细胞免疫表型分析2 N6 z7 t% I) C/ [. E- t

　　收集培养第3代细胞，以PBS洗涤2次，分成每管含2.5105细胞，分别加入小鼠抗人PE或FITC标记的单克隆抗体CD3、CD11a、CD29、CD31、CD34、CD73、CD45、CD44、CD105、CD144、CD49d、CD49e、CD62L和HLA-DR （均为Becton Dickinson公司产品）等10 μl，阴性对照管加FITC标记及PE标记的兔抗鼠IgG1各10 μl，4℃避光孵育30分钟，以PBS洗涤后用10 g/L多聚甲醛固定，用流式细胞仪检测分析。

　　成脂、成骨及神经诱导分化及分化后鉴定8 H, c2 S& v" i8 \& V+ j- _

　　消化体外扩增的第3代细胞，以5103/cm2的密度接种于预先放置无菌消毒盖玻片的6孔板中，制备细胞爬片，每孔加2 ml上述分离培养液。在细胞达到60％-70％融合时，更换诱导分化培养基。0 {8 r! b- a) t4 u  ?/ V5 k& i; p
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　　成骨诱导分化: c4 w, o3 Z0 C8 Y' J9 ?8 k
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　　诱导分化培养基为含有10-7mol/L的地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油，0.05 mmol/L 2-磷酸抗坏血酸（均为Sigma公司产品）和10％FBS的DMEM /F12培养液，每周换液2次，培养14天。取出玻片，用PBS洗涤1次，70％酒精固定10分钟，行茜素红及Von Kossa染色，镜检，照相。

　　成脂诱导分化

　　诱导分化的培养基为含有10-6mol/L的地塞米松，5μg/ml胰岛素，0.5 mmol/L 异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)，60 μmol/L消炎痛（均为Sigma公司产品）和10％ FBS的DMEM /F12培养液，每周换液2次，培养21天。取出玻片，用PBS洗涤1次，70％酒精固定10分钟，以油红O染色，镜检、照相。+ P5 N, q, q8 |! n  M+ X! ]
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　　神经诱导分化

　　诱导分化培养基为含20 ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、20 ng/ml人表皮生长因子（EGF）（均为PeproTech产品）、0.5 μmol/L全反式维甲酸（Sigma公司产品）和10％ FBS的DMEM /F12培养液，每周换液2次，培养14天。参照HistostainTM－plus试剂盒(SP-9002，北京中山生物技术公司产品) 操作方法进行抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色。实验对照用未诱导细胞爬片直接进行免疫组织化学染色。收获诱导14天细胞，TRIZOL (Invitrogen公司产品)提取总RNA，RT-PCR检测神经巢蛋白（nestin）及中间神经丝（NF-M）表达。nestin上游引物5’-AGGATGTGGAGGTAGTGAGA-3’，下游引物5’-TGGAGATCTCAGTGGCTCTT-3’，NF-M上游引物5’-GAGCGCAAAGACTACCTGAAGA-3’，下游引物5’-CGACTCTAGCTCGATGCTCTTG-3’。

　　统计学处理% U% S, ^* Z# Q2 o6 G

　　多组间的比较采用Kruskal-Wallis非参数估计，两样本间的比较采用Mann-Whitney 秩和检验。
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　　结果
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　　培养基种类对分离效果的影响

　　在低血清条件下，3种培养液中均可有贴壁细胞出现，在形态上这些贴壁细胞没有明显差异。在随后的培养过程中，DMEM/F12培养液中的细胞生长迅速，在第14天时每106 MNC形成的集落中位数为1.35个（1.1-1.5个），而在IMDM、DMEM-LG培养液中的细胞多数死亡，仅少数形成集落，每106 MNC形成的集落中位数分别为0.25个（0.1-0.4个）和0.05个（0-0.2个），明显低于DMEM/F12培养液（P7 i' q! @5 _6 \- B. s

　　初次换液时间对分离效果的影响

　　比较不同首次换液时间对原代细胞集落形成影响的结果表明，在首次换液时间为72小时的条件下，每106MNC形成的集落中位数为1.4个（1.1-1.5个），而在24小时、120小时换液的条件下分别为0.3个（0.2-0.7个）、0.7个（0.5-0.9个），前者明显高于后两者（P* N1 X' \8 ~! Y( x; G  G" ^
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　　初次接种密度对分离效果的影响3 @; I" \6 z& c0 o5 G# P
- Y, B! M; F* w3 x9 s) }
　　在以0.1106/cm2的密度进行接种时，脐血的MNC不能形成集落，黏附细胞不能传代培养。比较其余的接种密度表明，在相同培养时间内，接种密度越高所获得的原代集落数、P2代细胞数目越高（P0.05）（表1）。综合以上结果，在0.5106/cm2条件下接种细胞得率最高，但传代后细胞集落形成率较初始接种密度1106/cm2组低，后者能够兼顾所获细胞的数量与质量要求，是较为合适的选择。Table 1.Effect of initial plating density on isolation of MNASCs（略）7 ^- f, z/ K; C8 x- O

　　脐血质量对分离效果的影响
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　　分析不同时间以及MNC数的11份脐血分离培养成功率的结果见表2。虽因标本数少，未作进一步统计学分析，但从表中可以看出，脐血采集至分离的时间和脐血中MNC的数目可能对分离结果存在影响，采集至分离时间≤4小时且MNC细胞数≥1.2108的脐血分离成功率较高。
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　　脐血来源的多能非造血成体干细胞功能检测% x7 r& n, d5 I& ^
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　　根据上述研究，采用优选的分离培养条件（含2鸖、40% MCDB-201、10 ng/ml bFGF、1ITS的DMEM /F12培养液，以1106/cm2的细胞密度接种、72小时后换液），能够从脐血中分离出形态均一，且稳定传代的多能非造血成体干细胞（图1）。经体外诱导后具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能，前者以油红O染色可见胞浆充满油滴空泡;后者用茜素红染色，可见胞浆中有大量的钙沉积（图2），Von Kossa和ARS染色显示有黑色的钙化基质沉淀（图3、4）。在神经诱导分化后，分化细胞表达神经元细胞标志NSE 、NF-M 、nestin（图5）。细胞免疫表型检测表明，获得的细胞表达CD29、CD44、CD105，CD49e，CD73，不表达造血细胞的表型CD34、CD45，CD3，HLAII类分子HLA-DR 以及CD11a，CD31，CD62L弱表达vWF、CD44、CD49d等（图6）。Table 2.Characteristics of umbilical cord blood units（略）8 j1 o3 U, S5 l/ I

　　讨论

　　种子细胞是组织工程十分重要的原料，成人体内存在的多能非造血成体干细胞作为组织工程较为理想的种子细胞已经成为当前的研究热点。目前的研究已经证实，脐血中间除造血细胞外尚存在有这类多能非造血成体干细胞。但是此类细胞较低的含量促使我们必须寻找一种高效分离培养的方法以获得临床应用所需的细胞数量。因此，我们从几个方面对其培养方法进行研究，以探寻一种优化的培养方法，为脐血多能非造血成体干细胞在组织工程方面的应用作一定的探索。& ~; u) U, c# K+ Y6 Y% p9 {

高血清的条件下细胞容易发生分化，同时，血清成分复杂，虽含许多对细胞有利成分，也含有对细胞有害的成分，不同批号之间存在的质量差异，可能使得实验和生产难以标准化，不利于今后的临床应用。既往的研究已经证实，低血清培养液可有效地避免脐血间充质干/ 祖细胞丧失其增殖分化潜力［3］，因此在本实验中我们对在低血清条件下从脐血中分离多能非造血成体干细胞的相关影响因素进行了研究。

IMDM、DMEM－LG、DMEM /F12培养液是目前成体干细胞培养中应用较为普遍的培养液，在通常的培养条件下都取得了较好的培养结果，且DMEM/F12培养液更是作为无血清培养液的基础培养液得到广泛应用。我们的实验结果表明，在低血清的条件下，仅DMEM/F12培养液有利于脐血多能非造血成体干细胞的生长，IMDM、DMEM－LG培养液都难以满足这类细胞的生长要求。虽然有作者认为，含10% FBS的DMEM－LG低糖和偏酸性的环境能够减少造血细胞的污染，有利于从脐血中分离出具有多向分化能力的非造血前体细胞［1］，但是在降低血清浓度并进一步加入细胞生长添加剂的情况下，过低的糖浓度可能不利于细胞的生长。Sotiropoulou等［4］在研究影响人骨髓间充质干细胞(MSC)分离培养的因素时发现，骨髓MSC在IMDM培养液中生长不超过P1代，与其结果相似，我们也发现IMDM培养液在低血清的条件下难以支持脐血多能非造血成体干细胞的长期传代生长。3 E, o* A& C( V: N" `

由于目前从脐血中分离多能非造血成体干细胞多数仍然沿用脐血的MNC贴壁传代分离培养的方法，因此在原代接种时，脐血中的多能非造血成体干细胞与造血干祖细胞之间可能存在复杂的相互作用。造血细胞可能通过直接接触和分泌细胞因子影响其它细胞的生长。我们的研究表明，分离过程中初次换液时间过长，与造血细胞长时间的接触会抑制已经贴附的多能非造血成体干细胞进入增殖状态，影响所获细胞的数目及集落形成能力。这可能是由于营养消耗、细胞死亡等原因造成环境恶化所致，也可能与造血细胞分泌的细胞因子促进细胞分化有关。而初次换液时间过短，细胞未能充分黏附，也影响最终获得的细胞数目。

接种密度是原代培养中另一个关键问题，同样影响细胞之间复杂的相互作用。当原代培养的细胞初次接触体外环境时，细胞之间的相互影响是很重要的，细胞可能产生一些促生长活性物质来互相促进存活和生长。此外，细胞密度过大，贴壁细胞无足够的空间伸展；细胞密度过低时，细胞形成克隆和达到传代所需密度的时间又很长，造成原代细胞“老化”，使其在传代后的扩增能力和分化潜能都明显下降。对骨髓来源的MSC的研究表明，在10%-20%血清浓度下，低密度（1103/cm2）或极低密度（1或3个细胞/cm2）接种有利于MSC细胞的分离扩增［4，5］。但在实验中我们发现，在降低血清浓度的条件下，过低的初始接种密度不利于脐血多能非造血成体干细胞的分离，这与Tamama等［6］最近的研究相似，他们发现，在高密度培养时骨髓MSC对低血清环境的耐受性较低密度培养时更强。这可能与低密度培养时P21和P27细胞周期依赖激酶抑制剂表达减低，从而导致细胞凋亡［7］或是细胞间分泌的细胞因子不足，影响细胞的生长有关，而过高的接种密度则可能使造血细胞的影响更为明显，使细胞的获得率和CFU-F数降低。在兼顾所获细胞的数量与质量要求的条件下，采用初始接种密度1106/cm2较为合适。
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Bieback等［8］对从脐血中分离MSC样细胞的研究中发现，脐血量、采集至分离的时间及MNC的数目都是影响分离效率的因素，在采用理想的脐血（≤15小时、脐血量≥33 ml、MNC含量≥1108）条件下进行分离时，分离成功率明显增加。我们对不同时间及不同MNC数的11份脐血分离培养的成功率调查中也见有类似的趋势。采集至分离的时间及脐血中的MNC数目都可能是影响分离效率的重要因素。在采集至分离时间≤4小时且MNC含量≥1.2108的脐血标本的分离成功率较高，这一指标有可能作为今后优选脐血标本的标准。但仍需要进行扩大样本量的研究来证实。

利用我们的优化分离条件，我们检测了分离得到多能非造血成体干细胞（MNASC）的免疫学表型和分化潜能。结果证实，所分离的MNASC具有类似骨髓MSC的表型，并且具有成脂肪、成骨和神经分化潜能。细胞在此优化条件下能够稳定传代，并能满足将来组织工程的应用需要。8 x- Q7 `: r6 q" X" Y2 m2 x8 b
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