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作者：刘玉霞，范兴龙，江晨，邢成名 & ]/ R- W' A- c6 f
2 D& V/ T# t5 B- L2 E1 E6 f1 C
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: a, D: E+ e X$ J" Z5 B" X 6 N% C6 y$ E& ]1 U
2 F+ g! @ P# o
" G/ D- |( d) k5 A+ r 【关键词】干细胞;神经巢蛋白;胚胎;神经组织;免疫组织化学- F0 _: F# P! j# I, w
［摘要］目的 观察人胎脑组织有无神经巢蛋白（Nestin）阳性细胞存在。方法 收集胎龄为3个月左右的自愿终止妊娠引产的正常胚胎3例。应用苏木精-伊红染色和免疫组织化学方法观察人胎脑室管膜下区、海马、纹状体、丘脑、嗅球、皮质、脑干及小脑的Nestin阳性细胞。结果分别在人胎脑室管膜下区、海马、纹状体、丘脑、嗅球、皮质部位发现数量不等的Nestin阳性表达细胞，而在脑干、小脑未发现Nestin阳性细胞。结论 人胎脑室管膜下区、海马、纹状体、丘脑、嗅球、皮质多个部位存在数量不等的神经干细胞。8 y, X# A$ W, n0 z6 Y
［关键词］ 干细胞;神经巢蛋白;胚胎;神经组织;免疫组织化学
$ u- U" ~+ a/ ~, ]" M1 w POSITIVE EXPRESSION OF NESTIN IN HUMAN FETAL BRAIN AND ITS SIGNIFICANCE' R* P6 d6 |# Q- Z$ L5 {
LIU YU-XIA， FAN XING-LONG， JIANG CHEN， et al ( v$ j9 e P: @8 c' x' a
（Department of Neurology， Qingdao Municipal Hospital， Qingdao 266011， China）
# _( f" _6 V7 l& |: ^! D3 W/ r ［ABSTRACT］ObjectiveTo observe the presence or absence of nestin cells in different parts of human fetal brain. Me- thodsThree normal embryos of three-month old were collected from voluntary induced labor. The cells from hippocampus， stria-tum， ependyma， thalamus， olfactory bulb， cortex， brain stem and cerebellum of the brain were studied using HE staining and im-munocytochemistry. ResultsDifferent amounts of positive nestin cells were detected in the hippocampus， striatum， subependy-mal region， thalamus， olfactory bulb， cortex. Positive nestin cells were not detected in the brain stem and cerebellum. Conclusion Different amounts of positive nestin cells exist in the hippocampus， striatum， subependymal region， thalamus， olfactory bulb， and cortex of human fetal brain. - ^/ o/ O& Q$ H' a7 w) D
［KEY WORDS］stem cells; nestin; embryo; nerve tissue; immunocytochemistry
' L6 X8 C9 s% ]) R: K' d* m3 @ 经典的理论认为神经元是不能再生的。但是，在20世纪90年代中期，神经科学家发现成人和胎儿脑的某些部分（存在神经干细胞）可以产生新的神经元，至少是在一些特定的条件下可以产生。为明确神经干细胞在胎脑中的分布规律、特点和意义，为临床提供形态学基础，本研究收集自愿早期妊娠引产的胎儿3例，应用苏木精-伊红染色和免疫组织化学方法对胎脑室管膜下区、海马、纹状体、中脑、丘脑、小脑、皮质、延髓、嗅球等部位的脑细胞进行研究，以证明是否有神经巢蛋白（Nestin）阳性细胞的存在，从而解决中枢神经系统损伤修复治疗中神经干细胞的来源问题。 d. y1 @2 Y! y( v
1 材料和方法
+ P1 S- h$ |" D: s5 x 1.1 材料
. t$ |; i4 s2 d. w2 Q! u- m 1.1.1组织及来源 自愿水囊引产或米非司酮药物流产的新鲜人胚胎脑组织，胎龄为3个月左右（其父母知情同意），由青岛市市立医院妇产科提供。 , G$ @$ Z9 E& ?3 h
1.1.2主要药品及来源 羊抗人Nestin蛋白单克隆抗体（Santa Cruz公司），SP免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒（天津灏洋生物制品科技有限 公司），多聚甲醛溶液（上海太平洋化工公司）。 2 h$ f" X/ t# B& m
1.1.3主要器械和仪器 眼科剪，一套手术器械，LEICA-RM2015型切片机（上海涞卡仪器公司）， OLYMPUS -BH2显微照相仪（日本奥林巴斯公司），SY11-NI型电热恒温水浴箱（北京长风仪器仪表公司），摊片烤片机（孝感宏业医用仪器厂）。' y. \- ~1 k4 @1 N$ L/ T
1.2 方法
9 ], h3 y' p" x& b0 F 1.2.1标本采集和组织切片的制备 胚胎在娩出后0.5 h内取完整脑组织固定于中性甲醛溶液 0.5～ 1.0 h，待脑外层稍硬后，用手术刀轻轻刺破脑膜至浅层皮质以利固定液浸入，将胎脑组织固定 24 h。 然后小心剔除蛛网膜、软脑膜及血管，将手术刀两面涂匀甘油分别从嗅球、海马、中脑、丘脑、小脑、室管膜下区、纹状体、皮质、延髓和脊髓等不同部位各切取厚约0.5～1.0 cm脑组织一块或多块，切后勿使任何东西接触切面，迅速浸入新配的中性甲醛溶液再固定24 h。再按常规系列乙醇脱水，二甲苯透明，恒温箱（55～56 ℃）浸蜡、包埋，石蜡切片，切片厚约4 μm，粘于多聚赖氨酸处理后的玻片上，室温保存备用。 1 ]' u+ ~( X# t# m$ R3 X
1.2.2石蜡切片微波炉抗原修复 切片脱蜡至水后，体积分数0.03的H2 O2 处理5～10 min，蒸馏水 洗涤， 0.1 mol/L 的 PBS 浸泡 5 min 。将切片放入 盛有柠檬酸修复液的容器中，置微波炉内加热使容 器内液体保持在92～98 ℃并持续10～ 15 min 。取出容器，室温冷却10～20 min。0.1 mol/L的PBS浸泡5 min， 然后行免疫组化染色。 e% S" M( `8 N" F
1.2.3免疫组化染色 常规脱蜡，梯度乙醇水化至水。体积分数0.03 H2 O2 室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗， 0.1 mol/L PBS浸泡5 min。微波炉抗原热修复。 0.1 mol/L PBS洗5 min，共3次。滴加牛血清封闭液，室温孵育10 min。倾去血清，勿洗。滴加一抗羊抗人Nestin蛋白单克隆抗体（稀释度为1∶100），37 ℃孵育1 h。0.1 mol/L PBS冲洗5 min，3次。滴加特异性生物素化兔抗山羊二抗（稀释度为1∶100），37 ℃孵育15～30 min。0.1 mol/L PBS冲洗5 min，共3次。滴加过氧化物酶复合物， 37 ℃ 孵育10～30 min。0.1 mol/L PBS冲洗5 min，共3次。滴加DAB显色剂显色3～5 min或更长时间，普通光学显微镜下观察显色情况。自来水充分冲洗。苏木精复染1～2 min，水洗终止反应。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，凉干后，中性树胶封片，光镜下观察，细胞浆出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。取部分切片，不加一抗，以0.1 mol/L PBS代替，不出现阳性细胞，说明一抗具有很强的特异性。
: W) k9 D" o r2 _( N+ [& M1 o 2 结果 / I/ ~- L4 [4 m
Nestin阳性着色为棕黄色颗粒，主要位于神经干细胞的胞浆中，个别细胞胞核着色。阳性细胞呈单个细胞或成簇存在，着色较均匀。在胎龄3个月的人脑组织中，室管膜下区、海马、纹状体、丘脑、嗅球、皮质等部位发现数量不等的Nestin阳性着色细胞。在小脑、脑干、脊髓部位未检测到Nestin阳性细胞。Nestin阳性细胞形态各异:有的呈椭圆形，体积较大，未见明显突起，着色胞浆较疏松;有的Nestin阳性细胞稍小，胞浆致密;部分细胞呈三角形或不规则形。其中，海马Nestin阳性细胞密度最大，其特点为:细胞成簇聚集，细胞大小均匀，呈圆形、锥形、椭圆形或三角形。细胞核体积较大，Nestin阳性表达的胞浆位于胞核的一侧。丘脑Nestin阳性的神经干细胞呈单个分布，细胞形态不规则，核染色质疏松，Nestin阳性表达的胞浆位于核周围。纹状体细胞密集，其Nestin阳性神经干细胞散在分布，细胞形态以圆形为主，也有不规则形，核稍大，染色质疏松，Nestin阳性表达颗粒呈棕黄色分布在胞浆，分 布不均匀。皮质细胞排列较疏松，神经干细胞呈椭圆形，散在分布，核小，胞浆或胞核中均可见Nestin阳性表达，染色较致密。室管膜下的神经干细胞，核小，染色质致密，Nestin阳性表达均匀分布于胞浆或胞核呈致密颗粒状;细胞呈圆形、椭圆形、三角形。嗅球神经干细胞体积稍大，呈单个分布，Nestin阳性表达呈棕黄色疏松颗粒均匀分布于宽大的胞浆，细胞核较小。
" M7 ] I' P- g9 a- c; o 3 讨论+ j+ O9 n+ x& `0 Z* B
3.1 神经干细胞的鉴定 常用的神经干细胞标记物包括:Nestin和Vi- mentin ，二者均为中间丝蛋白;Musashi，一种RNA结合蛋白;胸腺嘧啶核苷和溴脱氧核苷（Brdu）。其中，多数实验以Nestin为神经干细胞的标志物;Br-du常用于追踪活体内神经干细胞移植后其成活、迁移及分化趋势。研究发现这些标记物是选择性的，对神经干细胞不是特异性的，因而，较之简单地查找到标记物存在，做功能分析检测出干细胞的特性（具有自我更新和多分化潜能）是种更好的方法。巢蛋白，为第Ⅳ类中间丝蛋白，分布在细胞浆内，呈波形分布，在核周围聚集，以放射状形式从核周围发散出去，参与细胞骨架的构成。巢蛋白主要在未分化、具有分裂能力的细胞中表达，巢蛋白为早期原始神经细胞的标志，是神经干细胞和祖细胞的标志物。目前，大多数研究以巢蛋白作为神经干细胞的标志物。免疫组化证实所有神经干细胞均呈Nestin阳性。本实验也以巢蛋白检测人胎脑组织有无神经干细胞的存在。: Z; P. c6 P. z0 u5 `
3.2 神经干细胞的分布 1992年REYNOLDS等［1］从成年小鼠纹状体分离出能在体外增殖、具有分化潜能的细胞群，提出了神经干细胞概念，同时也引起了成年中枢神经系统是否存在神经干细胞的争论。1998年ERIKS-SON等［2］报道成年人脑内如海马也存在神经元前体细胞。现已证实成体哺乳动物中枢神经系统中存在两个神经干细胞聚集区:侧脑室壁的脑室下区（SVZ）和海马齿状回的颗粒下层（SGZ）。其中SVZ的细胞分为两类，一类为正在增殖的祖细胞，另一类为基本处于静息状态的干细胞。用免疫荧光标记SVZ的干细胞，在活体可以清晰地看到增殖的细胞从脑室迁移到嗅球的轨迹。SGZ的干细胞则发育形成颗粒细胞，并与海马齿状回建立突触联系。成人的两个神经干细胞聚集区中的神经干细胞多处于静止状态，一旦机体损伤时即被激活，发生增殖、迁移并分化，从而促进神经元再生及损伤部位脑组织结构和功能的恢复［3］。目前已分别从胎鼠的小脑半球、中脑、海马、皮质、纹状体、坐骨神经和脑室区分离培养出神经干细胞。对人胚神经干细胞的研究中，先后从大脑皮质、海马、纹状体、嗅球、脑室沿线（包括侧脑室、第三脑室和第四脑室）、间脑、中脑、小脑、脊髓、视网膜中分离得到神经干细胞。动物实验证实胎脑的发育过程中存在神经干细胞，越早期的胎脑神经干细胞的比例越高，随着胎龄增加，神经干细胞的数量逐渐减少，至出生时则只有脑室周围区、纹状体区含有一定比例的干细胞。大多数实验证实神经干细胞在胎脑内分布，均自动物或人胎脑神经组织分离得到神经干细胞，体外单个细胞培养增殖形成细胞克隆球，在培养中加入生长因子等可分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。国外文献未见到有关人胎脑组织Nestin阳性表达的实验。国内有少数人曾做过这方面的研究。尹晓娟等［4］发现不同胎龄人胎脑海马均存在神经干细胞，多数单个散在分布于其他神经元间，可见对称分裂现象，各组神经干细胞随着胎龄的增加呈减少趋势。周细中等［5］应用免疫组化研究表明，在人胎 脑的纹状体、海马、室管膜下区存在神经干细胞。本实验在人胎脑的室管膜下区、海马、纹状体、丘脑、嗅球、皮质部位发现数量不等的Nestin阳性表达细胞。其中，海马组织分布神经干细胞最多，推测海马可能是神经干细胞的发源地。本文结果表明，人胎脑多个部位存在神经干细胞，可作为神经干细胞的来源，经分离，体外培养，定向诱导分化，再移植到病人的受损神经组织内，达到修复受损中枢神经组织的目的。9 I1 T! c1 B. O5 w5 Q" E9 T f
［参考文献］9 v J* a4 s: `
［1］ REYNOLDS B A， TETZLAFF W， WEISS S， et al. A multi-potent EGF-responsive striatal embryomol/Lic progenitor cell produces neurons and astrocytes［J］. J Neurosci， 1992，12（11）:4564-4574.
T$ K7 {0 h/ X* y9 P% b2 k( G ［2］ ERIKSSON P S， PERFILIEVA E， BJORK-ERIKSSON T， et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus［J］. Nat Med， 1998，4（11）:1313-1317.
) l# u; S5 S# K( S( I$ A, ~ ［3］ REYNOLDS B A， WEISS S. Generation of neurons and astro-cytes from isolated cells of the adult mammalian central nerv-ous system［J］. Science， 1992，225:1707.
6 K4 M8 M7 X7 [6 E2 t ［4］ 尹晓娟，杜江，封志纯，等. 人不同胎龄胎脑海马神经干细胞发育规律初探［J］.第三军医大学学报，2004，26（22）:2061-2063.8 }& }- B( E' ]. }) L% k. [ u
［5］ 周细中，封志纯，王斌，等. 人胎脑Nestin 阳性神经元的发育［J］.中国当代儿科杂志，2003，5（4）:311-314.
" }1 O& k9 Y) t% N （本文编辑 马伟平）) L9 Y% e) b2 d, K' f- }
（青岛市市立医院神经内科，山东 青岛 266011） |
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发表于 2009-3-3 11:46
发表于 2015-6-26 23:07
