ACS Catalysis：“一锅酶法”制备氟苯尼考合成的最直接手性中间体

yinfuhua

ACS Catalysis：“一锅酶法”制备氟苯尼考合成的最直接手性中间体3 s- ?. h8 a/ x/ p! E
来源：上海交大 2021-06-13 16:54' ~; y) X! c, w  a! N3 z

) q, d+ h5 l" t( {1 U近日，国际知名期刊《ACS Catalysis》在线发表了生命科学技术学院林双君团队的研究成果“One-Pot Asymmetric Synthesis of an Aminodiol Intermediate of Florfenicol Using Engineered Transketolase and Transaminase”。林双君教授为通讯作者，生命科学技术学院研究生刘琦为第一作者。9 I, T7 N- i4 q- ^3 k9 L* ^

  i) |( ~* G2 k6 }6 P: p在对转酮酶和转氨酶催化机制和蛋白结构认识基础上，利用分子对接手段建立了酶-底物结合模型，并基于此设计半理性突变策略，翻转了转酮酶的立体选择性，转氨酶的对映体偏好性和醛酮选择性，进而偶联转酮酶和转氨酶突变体一锅法合成了末端羟基手性中间体(1R，2R)-对甲磺砜基苯丝氨醇，产率可以达到76%，非对映体选择性最高为96% de 和对映体选择性>99% ee，为氟苯尼考的制备提供了最直接的手性中间体。6 L5 A, d* m. S+ l5 N
( q6 \. [* A# Z# M
基于设计，研究者从一系列转酮酶和转氨酶中筛选出能有效催化起始底物醛1的转酮酶突变体EcTK1和有效催化转酮酶产物2氨基化的ω-转氨酶ATA117。为了考察转酮酶的立体选择性，建立了一个通过非手性液相测定2立体构型的方法，即偶联一个对2基本无立体选择性的R-转氨酶突变体ATA117_AC，将(S)-和(R)-2分别转化成(1S，2R)-和(1R，2R)-3。从而可以确定EcTK1是S-选择性的，催化产生的羟酮中间体为S-构型（93.3% ee）(如图1所示)。由于所设计的路线是合成R-羟酮中间体，因此基于转酮酶的蛋白质结构和催化机制对该酶作了半理性改造。首先将底物醛1对接进EcTK1晶体结构的活性口袋中 (如图2A所示)，发现醛羰基与H26和H261存在氢键相互作用，而F434位于醛羰基的背面。因此提出一个假设，如果通过氨基酸突变改变醛羰基的定位，那么很有可能会改变羟酮产物的立体构型。为了翻转醛羰基的朝向，采用了“破而后立”的策略，即先打破现有的氢键相互作用，而后建立新的氢键相互作用。通过迭代的饱和突变和理性突变，获得了立体选择性完全翻转的EcTK1_YYF和EcTK1_YYH突变体，ee(R)分别为91.6%和95.2% 。通过将突变体EcTK1_YYH与底物醛1进行分子对接，证实了醛羰基的朝向的确发生了翻转，与背面的Y434形成了新的氢键。(生物谷Bioon.com）  j7 A! i( \/ @3 x7 _4 X

% t0 y, k. ?$ `/ J