CD19 CAR-T 细胞治疗临床试验之解析

whyboy

CD19嵌合抗原受体（CARs）是一个通过基因重组技术，将特异性识别CD19的抗体单链可变区与细胞外的一段铰链区，跨膜结构域，一个或多个胞内的T细胞刺激或共刺激分子融合而成的表达于T细胞表面的融合蛋白。第一代的CARs仅包括一个T细胞刺激分子（通常是CD3ζ），第二代或者三代CARs除了CD3ζ通常还有一个或多个共刺激分子（例如4-1BB，CD28）。当构成CARs分子的基因序列通过基因修饰转入T细胞，CD19 CARs在T细胞中的表达改变T细胞的特异性从而直接针对表达CD19的靶细胞进行作用。通常，CD19 CAR-T细胞在病人接受体内淋巴细胞清除的化疗治疗后输入患者，当CAR-T细胞在体内大量增值聚积的2-3周后会出现CD19阳性肿瘤细胞溶解的临床效果。这种治疗手段可能会导致患者产生细胞因子释放综合症（CRS），CRS的主要临床表现包括，发热，低血压，毛细血管渗出，凝血病，器官衰竭以及神经毒性。造成CRS的主要原因是例如IL-6以及γ干扰素等血清细胞因子浓度的增高。CD19 CAR-T的细胞免疫治疗在复发性B细胞急性淋巴细胞白血病中表现出了非常瞩目的疗效，并且在B细胞非霍奇金淋巴瘤以及慢性淋巴细胞白血病的治疗中也显示了令人鼓舞的效果。+ U$ U( W9 s* D# e

6 c& x$ B# ]) _, G8 t虽然CD19 CAR-T细胞免疫治疗目前依然尚未成熟，但很多研究中心已经开始积累并且报告了CAR-T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤中与生产以及CAR-T细胞的有效递送相关环节的重要经验。我们希望通过不同临床试验数据的对比能够找出影响CAR-T细胞免疫治疗结果的主要影响因素。需要注意的是，生产策略包括T细胞的分离以及刺激过程，CAR结构的设计，CAR基因的转导以及准备输入患者体内的细胞构成和扩增数量在不同的研究中心中都各不相同。由于很多生产细节收到专利保护，这也导致了对不同研究进行对比研究存在一定的困难。除此之外，淋巴细胞清除的化疗方案的选择，CAR-T细胞的输入剂量以及输入的时间点，治疗后评估以及再分期的一些方法在不同的试验中因为受试者以及入排标准的不同皆会不同。虽然相关试验数据以及临床试验结果总结分析得到的治疗模式也已经出现并且指导该领域的发展，但是在对比不同CAR-T细胞产品的不同临床研究结果时我们仍然需要谨慎分析其中的不同。
& T) X) Y( \4 p/ V2 y, S; D ) m* k8 D7 {2 [& o! |' O$ e
CAR-T细胞治疗的众多临床前研究已经表明CAR结构的设计，单链可变域的选择，胞外铰链区的长度以及构成，以及胞内共刺激分子序列的选择作为一种模式系统对CAR-T的临床效果有非常重要的影响。目前相关的临床试验表明含有CD28或4-1BB共刺激分子结构的CAR-T比单纯只有CD3ζT细胞激活结构的CAR-T更有效。与两项含有CD28 CAR结构的CAR-T细胞治疗临床试验相比，两项含有4-1BB CAR结构的CAR-T细胞显示出了在微量残留病灶阴性的完全缓解率以及CAR-T细胞存活周期的延长上更具有优势。然而，这些试验中除了共刺激分子不同，抗体单链可变区，铰链区以及跨膜结构域之间的不同，CAR-T细胞的生产，临床入排标准，淋巴细胞清除方案，治疗流程以及复发后治疗的选择的不同都给总结出CAR-T细胞治疗中最优化选择方案带来一定程度的困难。在NHL患者中的试验数据表明CD28或者4-1BB在治疗效果中并无显著性差异。显而易见，除了CAR-T细胞的生产以及递送，多种因素比如共刺激分子或者肿瘤细胞表面的抑制性分子均会影响其治疗结果，由此不同的临床情境下共刺激分子的选择也会不同。
# J/ K0 a1 D5 L, t" G/ G  S# b6 o
* Y% p/ G" y# B6 i' a在CARs分子基因序列的转导环节，目前临床应用的CAR-T主要通过逆转录病毒进行CARs基因的转染，gamma逆转录病毒和慢病毒的方法被平均使用。由于混杂效应，目前并无明确的数据表明何种转染发放更具优势，目前临床上对4-1BB的转染使用的是慢病毒，对CD28使用的是gamma逆转录病毒。除此之外，考虑到经济因素以及使用的简便性，非病毒转染过程也受到广泛关注，一些例如mRNA电转染，转座子-转座子酶策略也在进行，但尚缺乏充分的体外研究数据。
: B3 \2 y' \* k" } & y3 ?% `+ e6 P4 G, i$ e0 W2 [. U% v
CD19 CAR-T临床试验优化的一个难点是输入的CAR-T细胞缺乏均一性，异种模型的研究结果表明CAR-T细胞中不同T细胞亚型对B细胞淋巴瘤的清楚效果不同，因此，在T细胞改造前的初始T细胞种类构成对T细胞治疗效果具有重要的影响，这一点对于本身T细胞亚群构成高度多样化的B细胞恶性肿瘤患者来说尤其重要。Fred Hutchinson癌症研究中心（FHCRC）的研究者通过从T细胞中分离出CD4+细胞与CD8＋T细胞然后按一定比例组成最终的治疗用CAR-T细胞回输给患者，这一过程虽然较为复杂但是改善了输入细胞的均一性同时增强了输入的CAR-T细胞的剂量与毒性以及生物标志物之间在眼中的CRS反应中的可预测性。! Q: ~- ]* U: L1 E( q* E
, t, x% z& w  ^
通过上述方式，我们利用含有CD4阳性T细胞配合中央记忆性CD8阳性T细胞或者主体CD8阳性T细胞构成的CAR-T细胞治疗B-ALL患者，试验结果表明这两种组成的CAR-T细胞在接受治疗的患者中都表现出了几乎普遍的完全缓解，类似的高完全缓解率也发生在含有主体T细胞和CD4阳性T细胞的CAR-T治疗组中。针对非霍奇金淋巴瘤患者在自体外周血干细胞移植治疗后进行CAR-T 治疗的临床试验中，其两组不同的治疗用CAR-T细胞的构成分别为中央记忆CD8阳性T细胞和大型中央记忆CD8阳性T细胞。由于该试验样本较少，因此无法对比两组不同治疗组之间的差别，同时尚需更多的试验来论证不同T细胞亚型比例构成的CAR-T细胞是否影响CAR-T细胞的存活时间或者降低复发率。% Q* c. i% R" q. u; W3 ]
& I% F4 B4 u4 W! B& F6 _4 y) \
CAR-T细胞治疗中细胞递送的一个主要的挑战是从接受过化疗治疗后淋巴细胞减少的患者中生产足够的CAR-T细胞。FHCRC的研究者发现对经过CAR改造的T细胞用携带CD19的抗原呈递细胞进行单独刺激可以维持CAR-T细胞的体外培养增殖，该发现对于淋巴细胞减少严重的患者可以保证其进入临床试验。异源供体产生的CAR-T细胞同样可以适用于淋巴细胞减少严重的患者，尽管异体外周血干细胞移植在临床中作为一种可行的方案应用于患者，然而异种CAR-T细胞移植应用在非移植患者中的作用尚不清楚。. Y4 |) J, m: {9 L: B
2 h+ I8 N5 r5 g( R6 p
临床前研究表明在体外培养过程中限制CAR-T细胞的分化可以提升其国际性回输后的临床效果。限制细胞分化可通过例如补充不同细胞因子（使用IL-7和IL-15替代IL-2）或者改变培养过程的信号通路的方法实现。不同的临床用CAR-T产品的有不同的生产方法，例如回输前多克隆T细胞刺激，IL-2在培养过程中的浓度，或者体外抗原刺激都可以使输入患者的CAR-T细胞具有不同的分化状态由此影响治疗效果。然而与以上因素相关的具体临床数据目前尚未有更多公开信息。# M& e, [- j3 `* ^( Q

" S: J6 m- K/ L最后，治疗前患者淋巴细胞清除方案的选择也会影响CAR-T细胞在患者体内的扩增和存活。主要是因为是目前回输前的CAR-T细胞培养广泛使用IL-7和IL-15。一项临床研究表明，同时接受环磷酰胺和氟达拉滨用于T细胞清除的B-ALL患者其体内CAR-T增殖和存活时间优于只接受环磷酰胺的患者。引起这一现象的原因可能是CD8阳性T细胞会对鼠源的抗体单链可变区存在的抗原表位产生免疫反应，同样的免疫反应也会由CD4阳性T细胞引发。目前所有的CD19 CARs中都包括在人体中具有免疫原性的scFv以及融合位点，因此在对比不同临床试验中CAR-T细胞的维持情况就必须要先考虑淋巴细胞清除方案。尽管加用氟达拉滨可以提升CAR-T细胞的体内扩增和维持，然而淋巴细胞清除的最优化程度以及淋巴细胞清除的重要性在不同患者有所不同。对于有抗-CAR免疫反应风险的患者来说需要较为激进的淋巴细胞清除，对于另外一些患者，例如在进行自体外周血干细胞移植患者前进行过骨髓抑制处理的患者，由于清除了体内可用的抗原反而会削弱CAR-T细胞的作用。( e3 ]0 J* B* G2 w' J) ~5 k. Q+ q
4 R4 T2 A4 K% X6 f! W1 N7 U
目前CD19 CAR-T细胞在临床的成功应用是建立在众多临床前以及临床研究基础之上。尽管在CAR结构设计，生产策略以及临床递送的不同使得不同临床试验结果的对比存在困难，但是我们已经开始去寻找一些关键模式来指导未来CAR-T细胞免疫治疗方案的优化。1 _9 P- }, x' i+ N0 B+ B$ R2 \
参考文献：
8 Q- H4 v/ g1 ^) n- |Turtle CJ, Maloney DG. Clinical trials of CD19-targeted CAR-modified T cell therapy; a complex and varied landscape.Expert Rev Hematol. 2016 Aug;9(8):719-21.