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iu22ie33评论：我今天认真读了nat biotech关于韩春雨NgAgo这篇文章，很多感想。DNA-guided是这篇文章hallmark意义的由来。而NgAgo可以在37度负超螺旋，这是技术hardcore。另一个hardcore是NgAgo和24bp的gDNA结合，很大程度提高了靶向性（可能也会提高in vivo delivery效率，比gRNA易于绑aptamer）。NgAgo不需要PAM，低脱靶率，对GC配对识别率高。我觉得这个工作真的既简洁又清晰，载体（如CMV启动子的pGEX6P-1, pCNA3.1）、报告基因（eGFP）、FLAG-HA纯化、胶图都普通到不能再普通，远没那些大实验室那么fancy。我看了河北科技大学网站，这个学校1996年才建校，由河北轻化工学院、河北机电学院和河北省纺织职工大学合并而成。没有博士授予点，全校文理工商专业加起来才有48个教授。有趣的是，去年医学诺奖中国中医科学院的屠呦呦和此次河北科技大学的韩春雨，都没有受到过任何海外培训（不过人家都还是基础很好的，屠是老北医的毕业生，很精英；韩是协和强伯勤院士的博士生，强院士是中国做内切酶最好的，曾在NEB工作。而韩在强实验室发表过NRA），而这样草根的地方做出了大科研。这其实才是中国特色，真正的大贡献都来自草根阶层。而这说明几点，第一，许多生物研究资源（比如NCBI包括pubmed，PDB，引物数据库，测序，常用载体，蛋白纯化方法）无论是MIT也好还是河北科技也好，都是可以获取的，只要你有心有想法（当然需要大型仪器和经费支撑的基因组学和结构生物学另说）；第二，踏实勤奋其实是好的科研必要条件，现行科研体制（美国是鼻祖，中国学自美国）有些浮夸和浮躁，更像商业运营；第三，也是我今天跟同学讨论的，你所在的机构越好（比如broad或者RU这种神级机构），但作为年轻独立PI你所付出的许多努力是在维持在这些院所的生存。我跟同学开玩笑说，你在哈佛医学院能当一个正教授所需具备的能力可以去一个小国家当总统了，但你把这些努力用在别的地方，可能回报率更高，而不是只维系了一个在哈佛的教授头衔。
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孙学军评论：试读春雨老师新一代基因编辑技术的论文[p=28, null, left]5月2日，Nature系列顶级刊物《自然生物技术》在线发表，来自河北科技大学生物科学与工程学院青年教师韩春雨副教授“DNA-guided genome editingusing the Natronobacteriumgregoryi Argonaute”的重大原创性论文。文章瞬间刷爆微信朋友圈，这里面有两层原因，其一，该项新的基因编辑手段对目前热火朝天的CAS9技术提出了挑战；其二，领导该项研究的青年老师所在的单位和个人基本上籍籍无名。[p=28, null, left]到底这个研究为什么会有这样大的轰动，可以说一直关注生物医学进展的本人这次缺乏敏感性，今天早上才好好阅读这篇文章，因为分子生物学技术不是内行，只能看个大概。庆幸的是，文章写的比较通俗易懂，根据个人初步阅读理解，转告大家。[p=28, null, left]当今CAS9技术是利用RNA作为目标导向的基因编辑技术，存在一定问题，例如容易脱靶等，所以许多科学家都挖空心思地改造这个技术。Argonautes是研究了很长时间的一种酶，主要是作为调节RNA干扰系统所谓沉默复合体的有关研究。这个酶和CAS9有共同的生物学作用，也是对抗外源基因表达。不同的是CAS9只能依靠RNA作为指导，Argonautes不仅能依靠RNA也能依靠双链DNA。Argonaute有效地利用单链脱氧核糖核酸为介质精准地切割基因组靶点，这一现象最早是由荷兰瓦赫宁恩大学的约翰-范德欧斯特研究组发现。[p=28, null, left]何不利用这个特点，设计成能用DNA作为指导的新型基因编辑技术，不好的消息是，已经发现的Argonautes （Thermus thermophilus(TtAgo) 或Pyrococcus furiosus (PfAgo)）利用DNA的酶需要在65度以上才能发挥作用，这无法实现在活体细胞中编辑的目的，显然只要克服这个缺陷就可以实现目的。韩老师的基本思路是从蛋白质库中找存在类似功能序列的蛋白质，他们利用已经发现的Argonautes作为线索，通过PSI-BLAST技术附和前面两个酶特定氨基酸序列特征，尝试找到能在体温37度左右条件下工作的新酶，就是haloal-kaliphilic archaebacteriumN. gregoryi SP2 (NgAgo, protein identifier AFZ73749.1)。于是运气来临，使用这个酶设计出的利用DNA位导引的基因编辑系统，确实能结合双链DNA并靶向切割，当然少不了对这些切割的特点进行分析，例如需要磷酸化末端修饰什么的特征。然后继续研究证明这个系统效率高，很多场景都能用，更重要的是精确度特别高，不容易出错。最后是证明这个系统能进行基因组外源基因插入，Cas9这个的过程容易脱靶。所以新版基因编辑技术从工作效率到工作准度，都完胜大热门Cas9技术。是的，我们知道Cas9先是修饰细菌、真菌，真核、哺乳动物细胞和个体、人类细胞甚至胚胎修改等这样的工作序列，每个步骤都引起轰动，甚至因为伦理学问题不断引起大家关注。新的韩春雨版基因编辑技术系统一次性把上述工作彻底解决，将成为基因编辑领域的冲击波，2017年会大量出现相关论文，当然这个技术存在的不足也会不断被发现认识然后克服。[p=28, null, left]韩春雨版基因编辑技术（NgAgo-gDNA）更适合人类基因组编辑，性能超过最时髦的CRISPR-Cas9技术。这一发现会开启基因组工程的新篇章，之前基因组工程研究是基于RNA的CRISPR-Cas9、TALEN等，锌指蛋白也是基于DNA，但没有实现可编码的优势。强势新技术优点主要是这种技术的灵活性、准确性和广泛适应性。Cas9需要19个RNA碱基，在需要编辑的基因组上这19个碱基后面必须紧邻一个特征三碱基序列（PAM序列），这限制了gRNA的设计局限性，新版编辑技术不需要PAM序列，增加了技术灵活性。一般情况下，广谱性往往需要以精准性降低为代价，但是韩春雨版基因编辑技术没有这个问题，不仅具有灵活性，也同样具有精确性。因为NgAgo结合24个碱基gDNA，比Cas9的19个碱基gRNA长5个，理论上其精确性要提高1024倍。韩春雨版系统对向导序列-靶序列错配容忍度很低。gDNA上任何一个碱基的变换都会降低NgAgo的切割效率，如有三个错配则使其完全失活。这在另外一个机制上提高了NgAgo使用的精确性，特别是一些富含GC序列的地方，NgAgo系统比Cas9系统效率更高。NgAgo需要5’端磷酸化的单链DNA （5p-ssDNA），这种DNA在哺乳动物细胞几乎不存在，这保证了NgAgo不会被内源的DNA序列误导，产生错误编辑现象。外源5p-ssDNA转化到细胞，时间浓度可以精确控制。Cas9系统gRNA是内源表达，难以精确地控制。(本段参考网络信息)[p=28, null, left]后语，这个工作将来一定会引起广泛关注，国家可以重点投入，将初步的胜利扩大应用范围，用于基因编辑，畜农作物基因改良，利用这个技术可进行干细胞转化，人类基因治疗，动物疾病模型制备。一些生物技术公司会利用这个思路建立各种技术服务项目。个人生物技术爱好者会利用这个方法进行各自希望的基因编辑。[p=28, null, left]阅读Cas9相关文章的时候，多次曾经觉得为什么用RNA作为引导，而不是DNA，但是为什么就没有考虑到可以找到这种系统，将来是否有更理想的编辑系统。因为水平有限，可能存在错误理解，敬请指正。源自：http://blog.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=41174&do=blog&id=975926
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单链DNA向导的基因编辑技术 引言 《韩非子·喻老》一文中曾有言曰：“楚庄王莅政三年，无令发，无政为也。右司马御座而与王隐曰：“有鸟止南方之阜，三年不翅，不飞不鸣，嘿然无声，此为何名？”王曰：“三年不翅，将以长羽翼；不飞不鸣，将以观民则。虽无飞，飞必冲天；虽无鸣，鸣必惊人。”
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5月2日，Nature系列顶级刊物《Nature Biotechnology》在线发表了来自河北科技大学生物科学与工程学院青年教师韩春雨副教授题为“DNA-guided genome editing using the NatronobacteriumgregoryiArgonaute”的重大原创性成果。文章甫一发表，瞬间刷爆微信朋友圈，这里面有两层原因，其一，该项新的基因编辑手段对目前热火朝天的CAS9技术提出了挑战；其二，领导该项研究的青年老师所在的单位和个人基本上籍籍无名（抱歉，请允许我用了这个词）。 ) Q' Q+ K+ P4 B, s6 A1 B; C
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Nature Biotechnology文章截图 2 k; I0 Y7 x) H, w. g1 d
小编先引用河北科技大学生物科学与工程学院官网的报道来说明此项工作的重要意义。引用如下： “该研究成果找到了对基因组位点编辑范围更广的基因编辑工具。该工具完全不同于以RNA为向导的CRISPR/Cas9基因编辑技术：这种从古细菌来源的Argonaute（简称NgAgo），利用短链DNA作向导，真正实现了对基因组的任意位置进行切割，将基因编辑的可能性推入了更广泛的境地。该项技术具有以下明确优势：1. 向导设计制作简便：可以像合成PCR引物一样合成短链单链DNA向导；向导可直接转染细胞和组织而无需构建向导表达载体。2. 可编辑基因组内任何位置：Cas9基因组的靶点选择受到PAM区和富含GC区的限制。而NgAgo对靶点选择没有限制，对基因组任何位置都能有效引入双链断裂。3，由于向导核酸是DNA而非RNA，因此避免了RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或者脱靶效应。4，对游离于细胞核的DNA具有更高的切割效率。”
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河北科技大学生物科学与工程学院对该项成果报道的截图
0 [+ F! |) y; T8 i3 h2 f( Y由上述报道可知，该项技术相较于CAS9技术，的确有更大的优势，特别是规避了令人头痛的脱靶效应，其应用前景是不言而喻的。
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5 F1 h; b! U7 ]; ~, d. |小编写这篇文章更多的考虑是基于对韩老师的个人科研背景经历好奇。那么接下来，小编就综合各方面的信息评价来聊聊韩老师。 
. o# l6 t- |& V) v. l+ m; r% d; c韩春雨老师近照（来源：河北科技大学微信号）
) a8 S: @* y4 L; w% LBioArt建立了一个所谓的“全球顶尖生命科学交流群”（从群成员的实力来看，应该对得起这个称号，^_^），当该项成果发布在群中的时候立即引起了激烈的讨论，讨论者中不乏国内一流的PI和基因编辑专家，大家对这项成果给予一致的很高的评价。大家都说这项成果如果是放在大牛的实验室，估计CNS都会迅速发表，但从韩老师的这篇文章投稿日期来看前后折腾了差不多一年时间。群成员的整体感觉是这篇文章的意义甚至秒杀半数以上的CNS文章。怎么说呢，CNS在国内已经不稀奇了，随着大家的胃口越来越大，一般的CNS文章即便是开新闻发布会都难以广泛在国内同行中传播。但是韩老师这篇文章不同，同行们在感叹技术革新的同时，更多的是被韩老师在非常恶劣的科研条件下做出世界级的原创成果表示真心实意的佩服。
2 o: z' K2 z; E7 w0 z# D& [. j小编综合了各方面的资料先简要的介绍一下韩春雨老师的背景。根据官网显示，韩老师是1974年生的，河北石家庄人（MIT张峰博士原籍也是石家庄哦），今年42岁（这个年龄超过了“青年千人计划”、国家优青和青年长江学者所限定的年龄）。韩老师1992年本科毕业于河北师范大学，2000年在中国农业科学院获得硕士学位（导师：邱丽娟研究员 常汝镇研究员），2003年在中国协和医科大学/中国医学科学院获得博士学位（导师：强伯勤院士、袁建刚教授）。
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韩春雨老师硕士论文截图  , [, Y! B6 k8 r2 @ U \2 S
韩春雨老师博士论文截图
) V a& `/ W9 K. {3 F根据官网提供的信息来看，韩老师列出的近年来发表的文章如下： 1, Human Bex2 interacts with LMO2andregulates the transcriptional activity of a novel DNAbinding complex. ChunyuHan, Hao Liu, Kang Yin, Yi Xie, Xiao Shen, Yong Wang,Jiangang Yuan,BoqingQiang, Yong-Jian Liu*and Xiaozhong Peng* Nucleic Acids Research, 2005（BioArt注：这是博士期间的成果，毕业两年后发表） 2, GA signaling and CO/FT regulatorymodulemediate saltinduced late flowering in Arabidopsis thaliana. Kexue Li,YouningWang,Chunyu Han,Wensheng Zhang, Huizhen Jia, Xia Li Plant GrowthRegul. 2007 3, Arabidopsis EIN2 modulatesstressresponse through abscisic acid response pathway.Wang Y, Liu C, Li K, SunF, HuH, Li X, Zhao Y,Han C, Zhang W, Duan Y, Liu M, Li X.Plant Mol Biol. 2007 4, Saltinduced plasticity of roothairdevelopment is caused by ion disequilibrium in Arabidopsis thaliana.WangY,Zhang W, Li K, Sun F,Han C, Wang Y, Li X. J Plant Res. 2008 5，2012年 34卷 6期 遗传 封面 BEX2与INI1/hSNF5蛋白的相互作用及对S期细胞的影响韩秋悦范彦会王雅丽张少丹韩春雨（我校产权） 6，HeLa细胞中INI1通过与E2A作用下调CD117 ,《中国生物工程杂志》2011年第11期,范彦会;韩秋悦;王雅丽;韩春雨（我校产权） 1 E) l4 u: S2 f9 e& Y2 Y- k# r/ ^% h2 _
综合上述信息我们约略可知，韩老师除了一篇发表在NAR期刊上的一作文章，毕业后至今13年的主要成果是两篇中文文章（通讯作者）。小编从官网查到，韩老师所在的学院只有两名博导，很显然韩老师在此期间只是指导了为数不多的硕士生。很难想象，博士毕业13年几乎都没有一篇独立的所谓SCI文章，但肯定不是因为个人学术水平的问题（2005年发表NAR在当年算是很不错了，那个时期一篇自然子刊都可以评上院士的），俗话说“巧妇难为无米之炊”。据小编所知，韩老师的硕士同学曾透露，韩老师硕士期间被称为“特立独行的驴子”。小编还了解到，无论是韩老师的硕士同学还是博士期间师弟如今不少在国内知名院校都是独立PI了，并且有着很好的实验室。想到这里，在韩老师所处的环境下应该承受着极大的压力。 ! R7 {& r+ T! D" `0 X5 R& t
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韩老师以通讯作者身份在国内期刊上发表的两篇论文
+ Y( b( ?8 b0 E1 ]2 s5 l g做科研嘛，总是需要经费。公开信息显示，韩老师曾有两项基金（网上有人透露，韩老师可能用自己的钱做科研，这样的例子也是有的，这才是真爱啊），如下： 8 a# c! ?) f F) r8 n* l8 K
承担和完成纵横向科研项目情况 1，国家自然科学基金30700143：一个新的alpha-NCatenin 相互作用蛋白的鉴定及此项互作用的功能研究（主持）34万元。 2，国家转基因重大专项课题2009ZX08002-005B抗蚜转基因小麦新品种培育任务一抗蚜目的基因克隆及高效、特异转化体系的构建、改造及遗传转化 200万元（任务负责人） ; K$ m% ? r. ^
然而问题来了，很显然韩老师的NatureBiotechnology的文章所做的东西与上述基金内容无关，从致谢的内容可知，这篇文章只是挂了一个二作二单位的论文合作者的基金号，原因是用了浙大医学院方面的细胞流式分析。  , i. v9 @, O0 _/ D8 {
NBT文章的致谢截图
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说到底，原来这篇重大成果并没有收到科技部或者国家自然科学基金委的任何资助，这让谁汗颜？据网上有关信息纰漏，论文的一作高峰和韩老师在实验最艰苦最困难的瓶颈期时，甚至没有人看好，他们师徒二人苦苦支撑坚持做实验。简陋的实验室，很多需要的设备没有，用极少的钱做出举世瞩目的成果。 ! C: ~' s7 {6 ?
很遗憾，小编试图联系韩老师做个简短的采访，但是邮件发出去没有回音，可能韩老师这几天邮箱应该爆了，^_^。我想，敏感的同行们肯定开始发邮件寻求质粒了，做结构的估计也都蠢蠢欲动，君不见前几日3篇CNS的结构文章也刷了一会屏。CAS9刚出来那会各种模式生物试一遍好几篇文章，同时敲除几个基因也是Cell，然后稍微改造做成类似于抑制子的形式也是好几篇CNS，然后各种Nature protocol，Nature method满天飞。小编想着，河北科技大学是不是该紧张了，难道没有机构试图去挖人吗？^_^如果这样的话，我估计那就是赶紧要钱给钱要人给人，继续后续工作做得更完善扎实，把专利申请好，后面会有公司排着队来购买吧！ ' f* k# u/ p) K& E/ T6 R5 z! n. ~
这几天小编听到比较有意思的几个评论： 1、这个牛大发了，取消了PAM的限制，以及5'hairpinstemloop，而且直接用单链DNA。这些特质都完败crispr/cas9，效率看数据它们俩差不多。如果能够得到crispr/cas9在美帝相应的资源投入，对这个自然系统进行工程优化，有希望把crispr/cas9比下去。后发优势啊！doudna（甜圈）,church（教堂）,zhang看到这个工作估计特妈脸都绿了。忙活了半天被无名之辈超越了，脸往哪搁哦。
4 Q& W1 y# d' M' p: l2、14年这篇文章说TtAgo只能在 >65度的时候起作用，韩的文章是15年6月提交的，而且韩的文章的好多assay都是参考14年的nature的，这速度够快了啊！估计其他实验室也有人在做，但是没这么快？这片文章发现的蛋白质只针对ssDNA和超螺旋的质粒DNA，所以不可与河北这个组发现的蛋白同日而语。但是有可能前者给后者启发了灵感。读到14年的文章之后，大家玩命的去试那个蛋白的同源蛋白，运气好的人就试出来了。而CRISPR/Cas9的那帮大佬们太自信，看不上这些野路子，一如既往的在cas9系统上砸资源进行优化，最后傻X了：无名之辈竟然找到了天生丽质、不加雕琢就把Cas9比下去的系统。基因编辑白菜价了！ + ?9 X4 X! b c
总评：不管韩春雨老师博士毕业13年有什么样的成果，今天独此一项足以傲视群雄。最难得的是原创而不是跟进修修补补，推一座山再建一座山和在一座山上继续堆土相比，各中轻重行家们一看便知，小编就不直言了。论文折腾一年发出去的，想必在审稿中审稿人已经获知了，若是遇到那种压着论文抢idea的**审稿人就完蛋了，后续肯定立马有人跟进，这种情况下国家可以启动科研应激机制搞个大会战嘛，各种模式生物试一遍，各种结构解析赶紧上，进一步弄清楚完善，最后把专利搞好，诺奖级亦为可知。不得说不说根据14年的nature的论文信息找到合适的同源蛋白，运气是相当好了，不然65°是没法实验的，那么多同源蛋白应该没试玩吧，机灵的有条件的赶紧上啊，^_^。 ( W( {) p% ?6 E3 q4 o/ h" R
源自：http://www.dxy.cn/bbs/topic/33756631?keywords=新项目 ; K7 \5 \5 d2 t$ e7 m7 s: O
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发表于 2016-5-9 13:55
发表于 2016-6-26 15:15
