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一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
# C) P+ v* h4 V, R7 m3 u6 `ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
/ s6 \, @: x* G2 O
" U" O, S" y, E1 U
: Q. Z8 I# f2 e& o培养基
2 h1 V5 @& ^6 ]0 PES:) o$ u8 i) `+ F1 ^3 Z
配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。0 G: M9 L( \" W' ~. i& J
+ K2 {( J3 l3 J/ W2 L5 E( [
贮存液 + b$ m% S: a$ r, m
DMEM（高糖）
/ Q$ O6 C# @3 L2 K' T( E7 ?+ M2 ~马血清（HS） w7 O5 L$ b" w" j( `
L-谷氨酰胺（200mM）
! X( [! n4 ?3 F) m# {9 XMEM NEAA（10mM） * m! ~* Q/ f3 K. J. }* y
HEPES（1M） + K% w3 d* q3 ] P/ ?; C1 A9 z1 i
β-巯基乙醇（55Mm） ) o7 Y; V2 c; {
PEST
* P0 O- M/ E* AESGRO
. B% V1 x/ R$ h# I4 j& e% \+ j% \4 O4 F8 f
复苏细胞
6 N4 {1 G) l$ a4 J3 ^ v细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
2 t0 `+ \, [. j) D; S; s% m/ S( U$ i5 u" ~3 d% J; y% j
步骤：" n$ L; t9 u" a
1．从液氮中取出一管细胞；: U3 b! V4 q- \$ x( A, G
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
" w: e3 W. I7 m2 H' i, z( c0 U( T3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
! C7 r! }1 H$ e, q4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；6 m% w8 j5 _+ u5 b3 J, A
5．离心3分钟；
- g3 Q- O0 X, M9 _1 w; G- C6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；0 O/ @; j" s% N. t; o
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
6 B, ?$ |9 ?- }9 G8．孵育。* _! M0 e0 C! z+ J
. |: a: R2 F5 p, i- O
冻存细胞3 a, l1 ?7 L8 |+ z
冻存液
& j2 i2 U& T& u# z; X3 }90％HS和10％二甲基亚砜
; H; d- n! j0 T( Y1 E Q/ ^8 f$ V
, x3 T* x8 Z8 G步骤：
) W1 \4 S. Y; E1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；1 p# w) `/ F& W0 [
2．用细胞刮刀收集细胞；) m! f$ r; |4 G
3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；
, S% B) G9 t4 N; j! s4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）8 g! Y+ B y2 n
5．分装于冻存管内，每管1ml；
0 P( s) ?6 f) u( t2 U* c4 @6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。
/ a+ @. \/ S( `7 [# P7 e: l ~$ L+ n
明胶包被& Q3 t. H. _( u$ u
准备500ml 0.1％明胶溶液
) u e: ?7 G; `. q' b+ O1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。! [1 f0 y, |; I
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。
' w! Y/ `! Q. f. |) C) a/ `包被培养板或培养皿% y E: z7 t6 Y( K9 d
1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；
3 h B6 s4 J. c8 s" L9 B2．置室温30分钟；- i' }2 ~4 y4 |2 F
3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。 |
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发表于 2016-2-14 14:55
