胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)

风云动

一、细胞: v0 w3 F; p- R: R# L
4 I+ E. {4 M  |. A
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡
  p5 s9 \; J5 n/ e" u  \0 d6 [! ~# O/ M
1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由DrNgy的实室制备。- g% ~; K0 M/ Y7 Z0 b
5 n# S5 x, L, i5 L8 j
2．D3-ATCC;CRL-1934我们得到时大约传了17代。9 N7 y" T  ~4 O2 R$ \6 r
. c2 _- K9 f4 L  k' Z# p) ^/ Q$ `
3．J1-由DrJenish的实室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。
$ V/ h1 b" u6 u& P# n* G( e- n9 \8 k5 B; g9 h3 w6 L* p, N' e
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由DrJenish的实室友情提供。
0 V; i3 b5 x; _0 O: p
4 q- x, q% j8 `7 S: B' v( X) A 5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由DrNgy的实室提供。/ d' Y0 K" W9 I% ?0 T
1 _5 R! c- K  ]4 D& `
二、一般培养--维持ES细胞处于未分化状态2 q2 i1 ]7 e) M4 u* L

6 R; b$ v, C- e$ G$ V- [ ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有01％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在01％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。0 w: h& ?  ~% W

  T$ b8 E/ M  W1 R) f! L0 Q2 ~4 r 培养基
6 T$ C1 z* c4 i+ t' S4 _+ T8 w# i! S* U  `4 ~
ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50FALCON管中，（稀释为2×，每管42），贮存在-20℃。通过将21该溶液，HS和ESGRO加入450DMEM中制备培养基，02靘滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500。9 V' m% l0 F3 [/ H+ O9 B
* f0 {% T" z- F' @8 r
贮存液
7 w! I! L* @- \" b( }* F+ k
* ?$ ]0 e! U/ h; q" N5 m. N9 V; n DMEM(高糖)
( M+ o. Q5 B* f" U' H( Z/ J: i* A1 H! f) w- h
马血清（HS）
6 m- c% [& \$ ~1 V. g
( @. }  [) u8 `* W: {) D L-谷氨酰胺（200M）0 K. e# q7 {3 ]" N) t( ^4 x

) M) ~2 d7 r" d" c1 f* @ MEMNEAA（10M）
% Z$ v9 a, s: i/ k" t
$ i) I3 G0 z$ H2 x+ H/ c' o2 a HEPES（1M）- L5 }/ B7 o! E1 O. W+ J8 U' H
* h( U# N9 B7 `3 W' D/ b) \% q% _
?-巯基乙醇（55M）% n; v. w; E6 Y! g

- Z+ T+ y, F% E# c) S) P$ h PEST6 g% i1 X) U0 ~9 q, W

8 q! v  E( n% s7 n. F, { ESGRO
% I/ i- w/ h" j6 O
" ]0 p1 s# H! e7 p& D3 H" i 复苏细胞
/ ^% ]; R7 B* I7 f+ |  B+ B! a5 g, I( V+ T: [6 |
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。( H  u+ c" Q% U
# N$ y: Y- C3 r5 h& p
步骤! P  ]: }  r7 C

$ g# {- r- L6 g) ^* L2 d3 f 1．从液氮中取出一管细胞；) o0 Y( \; \( e: e/ F

' R" w) Z3 b0 f. [$ S( x 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；$ |! I; n, f( {6 C% h

% l8 V6 {& L; m1 r: U 3．将细胞转移到一15Fn管中；0 g9 I9 @9 c5 [! y: g
/ b* R& f5 Y8 A. f# g
4．加入5ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；* w4 s* S. C) W7 K% P

& q' Q. b' \5 Z$ T 5．离心3分钟；4 J: R. P. V2 \% v, h5 M3 {) D% c8 x5 P
- \' p' s9 H" A) M
6．弃上清，用2ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；+ @8 e1 d  Y1 B4 W
0 s& R! O8 a# [4 a- W
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6组织培养皿；
( x* A( A7 H: o
  M; |" H* M; G* l+ M4 I 8．孵育。