FITC

异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 

FITC是一种常用的绿色荧光探针。FITC的吸收(激发)和发射峰参见下表。 
Fluorophore             Absorption Peak(nm)                       Emission Peak(nm) 
 FITC                          492                                                      520 
当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下 
FITC-N=C=S  +  N-H2-蛋白质  →  FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 
    常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 
    1．Marsshall法 
    (1)材料    抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 
素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 
3．0的0．01mol／LPBS等。 
    (2)方法及步骤    ①抗体的准备  取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 
    ②荧光素的准备  根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 
    a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。 
    b．总蛋白量(AXB)＝crag。 
    c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 
    d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 
    e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。 
    f． PBS量D-(B+F)=GML。 
    注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。 
    ③结合(或标记)  边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。 
    ④透析  结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜。 
    ⑤过柱  取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．2)；过滤量：12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释1．7倍左右)。 
    2．Chadwick法 
    (1)试剂和材料    抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。 
    (2)方法及步骤    ①抗体准备  用o～4~C的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg／ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。 
    ②荧光色素准备  按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0．01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解。 
    ③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o～4~C冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18～24h。 
    ④透析和柱层析  方法同Marsshall法。 
    3．改良法 
    (1)试剂和材料    ①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至7．2。NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸馏水 
    ②0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液配法  取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。 
    ③3％碳酸钠水溶液配法  称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。 
    ④其他试剂和材料  l％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。 
    (2)方法及步骤    ①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0．15mol／LNaCl)及缓冲液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。 
    ②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4~C 
下电磁搅拌12～14h。 
    ③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。 
    ④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠o．01％，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可达2年以上。 
    4．透析标记法 

   此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。 
   (1)试剂和材料   试剂和材料同改良法。 
   (2)方法及步骤   ①用0．025mol／L碳酸盐缓冲液pH9．0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1％浓度，装入透析袋中。 
   ②用同一缓冲液将FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。 
   ③容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4~C电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4℃中。