MTT检测细胞活性

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MTT检测细胞存活率

1.实验原理

MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT主要用于药物(也包括其他处理方式如放射线)对体外培养的细胞毒性的测定和细胞增殖和细胞活性测定。

MTT检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在560nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

2.MTT溶液的配制

通常MTT配成的终浓度为5mg/ml，须用PBS(磷酸盐缓冲液，pH=7.4，与人体血液等渗，主要成分为磷酸氢钠、磷酸二氢钠、氯化钠以及氯化钾)或生理盐水做溶剂。

⑴对于100mg这样的小包装，建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。

具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。

⑵对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP(环氧树脂)管里，用的时候现配，直接往培养板中加。

注意事项：

    * 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

    * 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。

    * MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。

    * MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的薄膜手套 。

3.MTT法实验步骤

⑴培养细胞至对数生长期。

⑵用胰蛋白酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5~10×104/ml。

具体如下(以一般细胞培养常用的25cm2为例)：

1)细胞密度在长到约80%~90%，消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。

2)另取一支新的15ml无菌离心管（为下一步接种96孔板用），装入约9ml培养基。

3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml， 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5~10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5~10个细胞，如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。

4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细胞悬液密度为2×104/ml），细胞毒性实验每孔5000~10000个（相当于细胞悬液密度为5×104/ml）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。

⑶将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul,，这样待测细胞的密度为5000~10000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。

注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。

⑷将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间。一般5~7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔。建议设6个，否则难以反应真实情况。

对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走），再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。

⑸5%CO2，37℃孵育16~48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

⑹细胞培养结束前4小时每孔加入20ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

⑺终止培养，准备溶解结晶。 (用DMSO溶解)

1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan(结晶产物甲簪)结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。

2)每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪560nm处测量各孔的吸光值。

⑻同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

4.注意事项

(1)MTT应该新鲜配制，在4度保存最多不能超过2周，也有说10天的，反正不能太久。

(2)如果养细胞的时间长，中途不换液，96孔板周边的孔是不能用的，应加入无菌PBS。

(3)可以在700 nm做一个参比吸收，将每个孔的检测吸收减掉参比吸收后再分析。

(4)加入DMSO之前应尽可能将培养液弃除干净。

(5)DMSO溶后10min内测，越放颜色越深。

5.数据分析

理想的MTT实验中，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右。复孔直接的OD值差别一般应在0.1-0.15。待测溶液的透射比T在15%~65%之间，或使吸光度A在0.2~0.8之间，才能保证测量的相对误差较小。当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。